HPLC-MS/MS测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留试验研究

高均超

摘 要：因硝基呋喃类代谢物具有高毒性和致癌性，引起了相关部门和人员的高度重视。经过试验，简要研究了水产品中4种硝基呋喃代谢物——呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林残留的液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定分析方法。试验结果表明，这种方法灵敏、准确、高效，能够满足检测水产品中硝基呋喃类代谢物的要求。

关键词：硝基呋喃类代谢物；HPLC-MS/MS；质谱参数；色谱柱

中图分类号：TS254.7 文献标识码：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2017.06.029

硝基呋喃类药物代谢物主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因等，它们具有潜在的致癌性和诱导有机体产生突变的性质。目前，对硝基呋喃类药物代谢物残留的检测主要有液相色谱-质谱（LC-MS）法或液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法。本研究基于液相色譜-串联质谱的高灵敏度，简要探讨了水产品中硝基呋喃类代谢物残留量及其不确定度评定情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

主要仪器有API300串联四极杆质谱仪（产自美国ABI公司），配有电喷雾离子源（ESI源）和Agilent 1100 series高效液相色谱仪；Heraeus Biofuge Stratos台式离心机；WH-866旋涡混合器；pH计；恒温水浴振荡器；电子天平；OA-SYSTM氮吹仪；匀浆机；超纯水器；ZORBAXEclipseXDB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm×5 μm）。

1.1.2 试剂

标准品有呋喃唑酮代谢物AOZ、呋喃它酮代谢物AMOZ、呋喃西林代谢物SEM、呋喃妥因代谢物AHD，它们均由德国Dr．E公司提供。衍生化试剂，称取200 mg2-NBA（Sigma公司，德国）溶于12.5 mL的二甲亚矾中，现用现配。乙腈、甲醇、乙酸乙酯均为色谱级。定容液是质量分数为0.2%的乙酸，即乙腈15∶85（V/V），盐酸溶液（0.2 mol/L），氢氧化钠溶液（0.1 mol/L，1 mol/L）。

1.1.3 对虾

对虾样品由水产质量检测中心提供。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

1.2.1.1 标准储备液（0.5 mg/mL）配制

精密称取硝基呋喃类代谢物标准品AOZ，AMOZ，SEM，AHD用甲醇定容，4 ℃以下保存。

1.2.1.2 标准工作溶液的配制

将标准储备液用甲醇和水按照1∶1的体积比稀释至相应浓度，4 ℃以下保存。

1.2.2 样品和标准品处理

具体操作时，可参照GB/T 21311—2007操作，即称取2 g（精确至0.01 g）匀浆后的样品于50 mL离心管中，加入物质的量浓度为0.2 mol/L的盐酸溶液20 mL和衍生化试剂1.0 mL，漩涡振荡2 min，之后置于恒温水浴振荡器上37 ℃避光振荡水解过夜（约16 h）。取出冷却后，加入物质的量浓度为0.5 mol/L的磷酸氢二钠溶液1 mL，然后用物质的量浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.5.之后加入乙酸乙酯10 mL，振摇1 min，4 000 r/min离心10 min，收集乙酸乙酯层，再用乙酸乙酯10 mL重复提取1次，合并乙酸乙酯层，50 ℃氮气吹干，残留物用1 mL含质量分数为0.2%乙酸的1质量分数为5%的乙腈水溶液超声溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，取40 μL进样检测。

1.3 HPLC-MS/MS检测

1.3.1 HPLC条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，柱温为35 ℃，梯度洗脱程序如表1所示。

1.3.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI），扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测（MRM），电喷雾电压（IS）为5 500 V，雾化气（NEB）参数为10，气帘气（CUR）参数为11，碰撞气（CAD）参数为6，辅助气（AUX）流速为8 L/min，辅助气温度（TEM）为475 ℃，去簇电压（DP）为50 V，聚焦电压（FP）为350 V，碰撞室出口电压（CXP）为13.0 V，Q1、Q3均为单位分辨率（UNIT）。

2 结果与分析

2.1 测定方法的线性关系

采用内标法对定量离子对进行定量计算，将待测物浓度与内标物浓度的比值作为横坐标，将待测物峰面积与内标物峰面积的比值作为纵坐标，建立线性关系。

当待测物浓度在0.5～10.0 μg/kg的范围内时，4种硝基呋喃类代谢物均呈良好的线性关系，回归系数都在0.999以上。

2.2 样品测定

按照上述方法和条件检测样品，得出的质谱图如图1所示。

2.3 系统精密度

用所建立的检测方法测定加标的同一对虾样品，测定结果如表2所示。

2.4 回收率

以对虾空白样品为试验材料，向空白样品中分别添加质量分数为0.5 μg/kg、1.0 μg/kg和5.0 μg/kg的标准品，然后按照上述方法进行水解衍生，提取净化后用于测定，以内标法计算来验证方法的回收率。回收率共测定4组，每组取3次重复的平均值，每次处理共测定12次。

2.5 质谱条件的优化

根据硝基呋喃类药物分子的结构特征，将ESI（+）作为电离模式，采用半自动进样方式，分别用高质量浓度（1.0 mg/mL）的AMOZ、SEM、AHD和AOZ及同位素内标物AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-D3和SCA-13C-15N2的标准溶液在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，然后调节pH值至近7.4，再用乙酸乙酯萃取2次，氮气吹干，然后用甲醇/水溶液（1∶1，V/V）溶解残留物。接着以流动注射的方式在正离子模式下对4种代谢物和4种内标物的衍生化产物进行母离子全扫描，确定AMOZ、SEM、AHD、AOZ、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-D3和SCA-13C-15N2的m+1离子分别为m/z335，m/z209，m/z249，m/z236，m/z240，m/z340，m/z252和m/z212.然后分别将所得的m/z数作为母离子，对其子离子进行全扫描，并从中选取2个子离子。之后，多反应监测（MRM）优化去簇电压（DP）、聚焦电压（FP）、碰撞气（CAD）和碰撞能量（CE）等质谱参数。结果显示，以DP和CE对离子的丰度影响最大。接着用FIA方式继续优化雾化气（NEB）、气帘气（CUR）、电喷雾电压（IS）、辅助气温度（TEM）等参数。

3 小结

试验表明，该方法在硝基呋喃类代谢物——呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃西林（SEM）、呋喃妥因（AHD）的残留测定中，表现出专属性强、灵敏度高和准确度高的特点。因此，它可作为分析水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的有效手段。

参考文献

［1］赵东豪，黎智广，王旭峰，等.高效液相色谱-串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物的优化研究［J］.南方水产科学，2015，11（6）：58-64.

［2］周道志.水产品中硝基呋喃类代谢物残留量高效液相色谱串联质谱快速检测法的研究［J］.食品界，2016（6）：50-51.