CHK1和RAD51蛋白在食管胃结合部腺癌组织中的表达及意义

卫茹，闫静波

(1邢台医学高等专科学校，河北邢台054000；2河北医科大学附属邢台市人民医院)

CHK1和RAD51蛋白在食管胃结合部腺癌组织中的表达及意义

卫茹1，闫静波2

(1邢台医学高等专科学校，河北邢台054000；2河北医科大学附属邢台市人民医院)

目的 探讨细胞周期检验点激酶1(CHK1)和RAD51蛋白在食管胃结合部腺癌组织中的表达及意义。方法 选取食管胃结合部腺癌组织141例份(腺癌组)及距肿物≥5 cm的胃黏膜组织作为正常胃黏膜组；同期胃黏膜上皮内瘤变组织112例份，其中低级别上皮内瘤变44例(低级别瘤变组)，高级别上皮内瘤变68例(高级别瘤变组)。用免疫组化法和Western blotting法检测CHK1和RAD51蛋白在各组中的表达，并分析其与食管胃结合部腺癌患者临床病理征特的关系。Spearman 法分析RAD51与CHK1蛋白表达的相关性。结果 CHK1和RAD51蛋白在正常胃黏膜组、低级别瘤变组、高级别瘤变组和腺癌组中表达依次升高(P均<0.05)。CHK1蛋白表达与食管胃结合部腺癌患者病理分化程度及lauren分型有关(P均<0.05)；RAD51蛋白表达与患者病理分化程度、lauren分型及有无淋巴结转移有关(P均<0.05)；CHK1和RAD51蛋白表达呈正相关(r=0.342，P<0.05)。结论 CHK1和RAD51蛋白在食管胃结合部腺癌组织中呈高表达，二者在食管胃结合部腺癌发生发展和转移中起协同作用。

食管胃结合部腺癌；上皮内瘤变；细胞周期检验点激酶蛋白；RAD51蛋白

食管胃结合部腺癌是肿瘤中心位于胃食管交界(EGJ)及上下各5 cm 范围内的腺癌[1]，在我国河北省南部发病率较高，发病率约49.71/10万。细胞周期检验点激酶1(CHK1)是细胞检验点的转导因子，在多种肿瘤细胞中呈高表达，与肿瘤发生发展、肿瘤耐药性等密切相关[2]。DNA双链断裂修复蛋白RAD51是一种DNA双链断裂修复蛋白，能影响肿瘤发生发展，RAD51蛋白低表达，会造成胚胎死亡；RAD51蛋白适量表达，能修复自发性的DNA损伤；RAD51蛋白过量表达，能促进肿瘤的发生发展，增强肿瘤对放化疗的耐受性[3]。2015年2月～2016年8月，我们采用免疫组化和Western blotting法检测CHK1及RAD51蛋白在食管胃结合部腺癌组织中的表达，探讨二者在食管胃结合部腺癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2005～2015年在河北医科大学附属邢台市人民医院病理科食管胃结合部腺癌组织标本，且经过1位病理副主任医师诊断，1位病理主任医师复诊。食管胃结合部腺癌组织141例份(腺癌组)，患者术前均无放化疗，其中男93例、女48例，年龄<50岁56例，≥50岁85例。肿瘤最大直径<4 cm 78例，≥4 cm 63例；组织学分化程度：高分化50例，中低分化91例；lauren分型：肠型85例，弥漫型56例；癌组织侵犯黏膜层或黏膜下层(早期胃癌)32例，侵及肌层或浆膜层(中晚期胃癌)109例；无淋巴结转移81例，淋巴结转移60例；Siewert Ⅰ型6例，Siewert Ⅱ型71例，Siewert Ⅲ型64例。取141例食管胃结合部腺癌患者距肿物≥5 cm的胃黏膜组织作为正常胃黏膜组。选取同期胃黏膜上皮内瘤变患者112例胃黏膜上皮内瘤变组织，患者男62例、女50例，年龄38～71岁，其中低级别上皮内瘤变44例(低级别瘤变组)，高级别上皮内瘤变68例(高级别瘤变组)。以上四组标本分为两份：1份经甲醛固定，做HE和免疫组化染色；另1份放入液氮冻存，做Western blotting免疫印迹检测。

1.2 CHK1及RAD51蛋白表达检测方法 ①免疫组化法：CHK1及RAD51染色采用En Vision TM二步免疫组化染色方法。CHK1及RAD51蛋白在胞浆和胞核表达。根据着色强度的分值：无着色、着淡黄色、着棕黄色、着棕褐色分别计为0、1、2、3分。根据阳性细胞占总细胞数百分比的分值:阳性细胞<10%、10%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%分别为0、1、2、3、4分。着色强度分值×阳性细胞百分数分值计为免疫组化总分值，0～1分为阴性(-)，≥2分为阳性(+)。②Western blotting法:提取正常胃黏膜组、低级别瘤变组、高级别瘤变组和腺癌组蛋白，参照蛋白标准曲线测定蛋白含量，做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶内的样品蛋白转移至硝酸纤维膜上，5% BSA常温振荡封闭1 h。一抗体(CHK1及RAD51抗体)，4 ℃过夜，二抗，室温1 h。然后加入碱性磷酸酶显色剂显色20 min。用扫描仪扫描NC膜上蛋白表达条带的灰度，用自动图像分析系统进行定量分析，正常胃黏膜组的平均光密度值(OD值)取值为1，其他各组与正常胃黏膜组相比取值。

2 结果

2.1 各组CHK1、RAD51蛋白表达比较 免疫组化检测结果显示，正常胃黏膜组、低级别瘤变组、高级别瘤变组和腺癌组CHK1蛋白阳性表达率分别为9.22%(13/142)、22.73%(10/44)、48.53%(33/68)、79.43%(112/141),RAD51蛋白阳性表达率分别为8.51%(12/142)、20.45%(9/44)、44.12%(30/68)、72.34%(102/141),四组间CHK1、RAD51蛋白阳性表达率比较，P均<0.05。

Western blotting法检测结果显示正常胃黏膜组、低级别瘤变组、高级别瘤变组和腺癌组CHK1蛋白相对表达量分别为1、2.40±0.11、5.39±0.37、9.01±1.52，RAD51蛋白相对表达量分别为1、2.29±0.08、4.97±0.24、8.13±1.03，四组间CHK1、RAD51蛋白表达比较，P均<0.05。

2.2 CHK1及RAD51蛋白表达与食管胃结合部腺癌患者临床病理特征的关系 CHK1蛋白表达与食管胃结合部腺癌患者病理分化程度及lauren分型有关(P均<0.05)。RAD51蛋白表达与食管胃结合部腺癌患者病理分化程度、lauren分型及有无淋巴结转移有关(P均<0.05)。见表1。

表1 CHK1、RAD51蛋白表达与食管胃结合部腺癌患者临床病理特征的关系

2.3 RAD51与CHK1蛋白表达的相关性 食管胃结合部癌患者癌组织中CHK1与RAD51蛋白表达呈正相关(r=0.342，P<0.05)。

3 讨论

近年来，食管胃结合部腺癌发病率持续升高，进展快，约80%的患者发现已进入晚期，5年生存率低于30%[4]。与胃窦癌相比，食管胃结合部腺癌较早深层胃壁浸润、转移[5，6]。食管胃结合部腺癌最常用的分型为Siewer分型[7]。SiewertⅠ型预后最好，SiewertⅡ型次之，SiewertⅢ型最差。在我国，SiewertⅠ型少见，而SiewertⅡ和Ⅲ型多见。肖文光等[8]研究显示，我国的SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分别为3.9%、53.1%和43.0%；杨宏等[9]研究显示，我国的SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分别为4.7%、50.3%和45.0%。本研究收集食管胃结合部腺癌标本141例，SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型所占比例分别为4.3%、50.3%、45.4%，与文献报道基本一致。机体细胞周期的调控是复杂精密的程序，细胞周期检测点蛋白质缺失会引起细胞周期紊乱，造成基因组不稳定，与肿瘤关系密切[10]。研究显示，在多种肿瘤细胞中CHK1高表达，其在肿瘤发生发展、肿瘤耐药性等方面发挥作用[2]，CHK1异常表达会造成细胞周期检测点对DNA损伤失去修复作用，增加机体肿瘤易感性，引起肿瘤发生。

RAD51蛋白是一种DNA双链断裂修复蛋白，在同源重组修复中起重要作用，参与DNA损伤感应和细胞周期关卡的复杂信号通路，通过同源重组修复，Rad 51蛋白可保护细胞免受DNA损伤[11]。然而，过多的RAD51蛋白又会过量引起姐妹染色体交换和同源重组，结果会引起遗传的差异性和基因的不稳定性，造成肿瘤细胞过多增殖和不能分化成熟，引起肿瘤发生，并造成肿瘤细胞对放化疗耐药和预后不良[12]。Rad51蛋白的关键肽段发生突变，会引起该基因的失活，结果引起肿瘤形成。

本研究结果显示，CHK1和RAD51蛋白在正常胃黏膜组、低级别瘤变组、高级别瘤变组和腺癌组表达逐渐升高；CHK1和RAD51蛋白在中低分化胃腺癌的表达强于高分化胃腺癌。说明CHK1和RAD51蛋白可能促进了食管胃结合部黏膜的癌变及其发生发展。在食管胃结合部腺癌的临床病理因素中，CHK1蛋白表达与患者的病理分化程度和lauren分型有关，说明CHK1可能与食管胃结合部腺癌的恶性程度有关。随着肿瘤的进展，恶性程度的增高，CHK1蛋白表达升高，提示CHK1蛋白可能促进了食管胃结合部腺癌的发生发展。lauren分型弥漫型胃腺癌CHK1蛋白表达高于肠型胃腺癌，弥漫型胃腺癌主要包括低分化腺癌及印戒细胞癌，恶性程度较高；肠型胃腺癌主要指高分化腺癌，恶性程度较低，提示CHK1蛋白在低分化食管胃结合部腺癌中表达高，CHK1蛋白可能促进了肿瘤的发生发展，CHK1蛋白升高，患者预后差。本研究结果还显示，CHK1蛋白在有淋巴结转移者中的表达高于无淋巴结转移者，但差异无统计学意义。在食管胃结合部腺癌的临床病理因素中，RAD51蛋白表达与食管胃结合部腺癌的病理分化程度、lauren分型及有无淋巴结转移有关，说明RAD51可能是判断肿瘤恶性程度高低及分级、分期的重要标志。随着肿瘤进展，恶性程度增高，RAD51蛋白表达升高，提示RAD51蛋白可能促进了食管胃结合部腺癌的发生发展。RAD51蛋白在有淋巴结转移者中的表达升高，提示RAD51蛋白可能促进了食管胃结合部腺癌的淋巴结转移，RAD51蛋白表达可作为判断食管胃结合部腺癌患者预后的参考指标。食管胃结合部癌组织中CHK1和RAD51蛋白表达正相关，说明二者在食管胃结合部腺癌发生发展中起协同作用。

综上所述，食管胃结合部癌组织中CHK1和RAD51蛋白呈高表达，二者可能共同促进了食管胃结合部腺癌的发生发展。

[1] Hasegawa S, Yoshikawa T, Cho H, et al. Is Adenocarcinoma of the esophagogastric junction different between Japan and western countries?The incidence and clinicopathological features at a Japanese high-volume cancer center[J]. World J Surg, 2009,33(1):95-103.

[2]Russell MR, Levin K, Rader J, et al. Combination therapy targeting the Chk1 and Wee1 kinases shows therapeutic efficacy in neuroblastoma[J]. Cancer Res, 2013,73(2):776-784.

[3] Wang Z, Dong H, Fu Y, et al. RAD51 135G>C polymorphism contributes to breast cancer susceptibility:a meta-analysis involving 26,444 subjects[J]. Breast Cancer Res Treat, 2010,124(3):765-769.

[4] Siewert JR, Feith M, Stein HJ. Biologic and clinical variations of adenocarcinoma at the esophago-gastric junction:Relevance of a topographic-anatomic subclassification[J]. J Surg Oncol, 2005,90(3):139-146.

[5] Ohno S, Tomisaki S, Oiwa H, et al. Clinicopathologic characteristics and outcome of adenocarcinoma of the human gastric cardia in comparison with carcinoma of other regions of the stomach[J]. J Am Coll Surg, 1995,180(5):577-582.

[6] Saito H, Fukumoto Y, Osaki T, et al. Distinct recurrence pattern and outcome of adenocarcinoma of the gastric cardia in comparison with carcinoma of other regions of the stomach[J]. World J Surg, 2006,30(10):1864-1869.

[7] 薛英威，于雪峰.提高对食管胃结合部肿瘤的认识[J].中华胃肠外科杂志，2013，16(6):125-127.

[8] 肖文光，马可，彭林，等.食管胃交界部腺癌淋巴结转移特点及手术方式选择[J].中华胃肠外科杂志，2012,15(9):897-900.

[9] 杨宏，武爱文，季加孚，等.食管胃结合部腺癌471例Siewert分型临床研究[J].中国实用外科杂志，2012,32(4):310-315.

[10]Ahmed A, Yang J, Maya-Mendoza A, et al. Pharmacological activation of a novel p53-dependent S-phase chechpoint involving CHK-1[J]. Cell Dedth Dis, 2011,19(2):160.

[11] Schild D, Wiese C. Overexpression of RAD51 suppresses recombination defects:a possible mechanism to reverse genomic instability[J]. Nucleic Acids Res, 2010,38(4):1061-1070.

[12] Shi S, Qin L, Tian M, et al. The effect of RAD51 135 G>C and XRCC2 G>A (rs3218536) polymorphisms on ovarian cancer risk among Caucasians:a meta-anlysis[J]. Tumor Biology, 2014,3(4):1-8.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.020

R735.2

B

1002-266X(2017)09-0061-03

2016-12-07)