CYLD在胰腺癌组织中的表达变化及意义

姜维民，徐小永，李春民，杨捷，周昆明，吕伟，周丁华

(1中国人民解放军火箭军总医院，北京 100088；2首都医科大学附属北京朝阳医院)

CYLD在胰腺癌组织中的表达变化及意义

姜维民1，徐小永1，李春民2，杨捷1，周昆明1，吕伟1，周丁华1

(1中国人民解放军火箭军总医院，北京 100088；2首都医科大学附属北京朝阳医院)

目的 观察胰腺癌组织中头帕肿瘤综合征蛋白(CYLD)的表达变化并探讨其意义。方法 收集44例胰腺癌患者术后的癌组织和癌旁正常胰腺组织标本，采用免疫组化SP法检测CYLD表达，并分析CYLD表达与胰腺癌患者临床病理特征及预后的关系。结果 胰腺癌组织、癌旁正常胰腺组织中CYLD阳性表达率分别为45.45%(20/44)、75%(33/44),二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。胰腺癌组织CYLD表达与胰腺癌患者的N分级、AJCC分期和组织分化程度有关(P均<0.05)，而与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位及CA199水平无关(P均>0.05)。CYLD表达与胰腺癌患者的生存时间有关(P<0.01)，CYLD低表达者中位生存时间为8.27个月(95%CI为5.61～10.88个月)，2年累积生存率为5.4%，而CYLD高表达者中位生存时间为16.72个月(95%CI为14.12～19.31个月),2年累积生存率为17%。Cox回归分析提示CYLD为胰腺癌患者的独立预后因子(RR=3.839，P<0.05)。结论 CYLD在胰腺癌组织中表达下调，其异常表达可能与胰腺癌发生发展有关，检测其表达有助于患者预后判断。

胰腺癌；头帕肿瘤综合征蛋白；免疫组织化学；临床病理特征

胰腺癌是常见高度恶性的消化道肿瘤之一，近年来发病率逐年上升。2006～2010年，胰腺癌连续位居我国恶性肿瘤发病率的前10位[1]。由于发病隐匿且缺乏特异性临床症状，早期诊断率低，且胰腺癌恶性度高，发展迅速，早期即可侵犯血管，因此患者的预后极差。目前，对早中期胰腺癌的治疗仍以手术切除为主，辅以放化疗等。晚期胰腺癌的治疗手段较局限，急需新型靶向治疗药物。头帕肿瘤综合征蛋白(CYLD)是一种细胞内多功能去泛素化酶，其失活在肿瘤发生、发展过程中起重要的调节作用，而关于CYLD在胰腺癌组织中的表达研究较少。因此，我们采用免疫组化法检测了44例胰腺癌患者癌组织中CYLD的表达，并分析CYLD表达与胰腺癌患者临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2012年1月～2014年2月于中国人民解放军火箭军总医院(即前第二炮兵总医院)肝胆外科接受手术治疗的44例胰腺癌患者癌组织标本，患者男27例、女17例，年龄20～79岁、中位年龄61岁。患者术前均未进行化疗、放疗、介入等辅助治疗，所有病例术后经病理医师确诊为胰腺癌，肿瘤的分化程度依据Edmondson-Steiner分级标准来确定，同时依据美国肿瘤研究联合委员会(AJCC)2010发布的第七版分期标准进行分期。其中低分化13例，中分化14例，高分化17例；Ⅰ期10例，Ⅱ期20例，Ⅲ期5例,Ⅳ期9例。同时取距肿瘤边缘5 cm的组织(经镜检证实未被肿瘤侵犯的正常组织)作为对照。患者术后定期随访，采用电话与来院相结合的方式，每3个月行腹部B超检查一次，必要时行腹部CT检查。

1.2 胰腺癌组织中CYLD表达检测 采用免疫组化SP法，试剂为Sigma公司兔抗人CYLD抗体(1∶200)；免疫组化严格按照试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照。由两名互相独立且对研究内容并不知情的病理医师对免疫组织化学染色切片进行观察评分。400倍放大视野下，随机选取10个独立区域进行观察和细胞计数。用以下两种方法对切片进行半定量评估：①阳性染色细胞比例评分：0分(无阳性染色细胞)；1分(阳性染色细胞比例<10%)；2分(阳性染色细胞比例<50%)；3分(阳性染色细胞比例>50%)。②染色强度评分：0分(无染色细胞)；1分(染色程度弱为淡黄色)；2分(染色程度中等为黄棕色)；3分(染色程度强为棕色)。染色评分采用以下公式进行计算：染色评分=阳性染色细胞比例评分×染色强度评分。应用上述方法评估每张切片的染色评分(分值分别为0、1、2、3、4、6、9分)。根据Log-Rank检验结果确定最优截止值：≥4分为CYLD高表达，≤3分为CYLD低表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料用卡方检验，四格表中期望值<5时，采用Fisher确切概率法等；对临床病理特征及CYLD的相关性用Spearman相关性分析；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-Rank检验分析CYLD表达对患者总体生存时间(OS)的影响，采用单因素和多因素COX回归分析确定CYLD是否为胰腺癌患者的独立预测因子。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织和正常组织中CYLD表达比较 免疫组化检查结果显示，正常胰腺组织中CYLD在胞质及胞核中均有不同程度表达，而癌组织中胞质染色明显降低，胞核中几乎不表达。胰腺癌组织切片中CYLD表达相对较弱，阳性表达率为45.45%(20/44)，而正常胰腺组织切片中CYLD表达较高，阳性表达率为75%(33/44),两者比较差异有统计学意义(P=0.005)。

2.2 CYLD表达与胰腺癌患者临床病理特征的关系 CYLD表达与胰腺癌患者的N分级(P=0.003)、AJCC分期(P=0.029)和组织分化程度(P=0.024)有关，而与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位及CA199水平表达无关(表1)。

2.3 CYLD表达与胰腺癌患者预后的相关性 Log-Rank检验显示CYLD表达与胰腺癌患者的生存时间显著相关(P=0.002)。另外，CYLD低表达者中位生存时间为8.27个月(95%CI，5.61～10.88个月)，2年累积生存率为5.4%，而CYLD高表达者中位生存时间为16.72个月(95%CI，14.12～19.31个月),2年累积生存率为17%。COX回归分析结果提示M分级、AJCC分期和CYLD表达为胰腺癌患者的独立预测因子(P均<0.05)。

表1 CYLD表达与胰腺癌患者临床特征的关系

注：#采用Fisher确切概率法。

3 讨论

CYLD是一种细胞内多功能去泛素化酶，能去除RIP1、TRAFs、NEMO和Bcl-3等信号分子K63多泛素化链，使其去泛素化而影响NF-κB、TGF-β及JNK等多条信号通路，从而调控细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及血管生成等多种生物学过程，在肿瘤发生发展过程中发挥抑癌基因的作用[2,3]。Hayashi等[4]采用qRT-PCR及免疫组化法检测CYLD mRNA及蛋白在乳腺癌癌组织及癌旁正常乳腺组织中的表达，发现在乳腺癌组织中CYLD mRNA及蛋白表达均显著降低甚至表达缺失。Herllerbrand等[5]采用qRT-PCR及免疫组化法检测了结肠癌及HCC癌组织，发现CYLD在结肠癌及HCC癌组织中的表达显著降低。同样，CYLD在恶性黑色素瘤、宫颈癌、甲状腺癌和慢性淋巴细胞性白血病等恶性肿瘤组织和(或)肿瘤细胞中低表达甚至不表达，而在正常组织和(或)细胞中高表达[6～9]。因此我们推测，CYLD失活在肿瘤发生发展过程中起重要调节作用。

本研究结果显示，胰腺癌组织中CYLD表达显著下降，通过免疫组化法检测我们观察到正常胰腺组织中CYLD蛋白在胞质和胞核内均有表达，但胰腺癌组织中CYLD表达下降，尤以胞核内下降显著，在低-中分化胰腺癌中，胞核内CYLD几乎不表达，提示核内CYLD表达与肿瘤预后存在一定联系，此与Welte等[10]在肝癌中的研究结果相似。对CYLD表达与胰腺癌患者临床病理特征间的相关性分析发现，CYLD表达与N分级、AJCC分期及组织分化程度有关。CYLD表达随分化程度的降低而降低，随AJCC分期的增加而降低。虽然分析结果提示CYLD表达与M分期无相关性，但9例远处转移的胰腺癌患者中，7例CYLD表达下降，这可能说明一定的趋势，但仍需大样本的统计分析。此外，通过Log-Rank检验发现CYLD与患者的生存时间相关，CYLD低表达者2年生存率明显低于CYLD高表达者。单因素和多因素COX回归分析显示，CYLD为胰腺癌患者的独立预后因子，此与其他研究者在乳腺癌、慢性淋巴瘤及肝癌中的结果一致[4,9,11]。徐小永等[12]研究结果显示，CYLD基因转染可抑制人胰腺癌PANC-1细胞的增殖并诱导其凋亡。提示CYLD或许可作为一项新的生物学标记物，有助于胰腺癌早期诊断、临床分期及预后评估。

综上所述，CYLD在胰腺癌组织中表达下调，其异常表达可能与胰腺癌发生发展有关，检测其表达有助于患者预后判断。

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周丁华(E-mail:zhoudh@sina.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.016

R735.9

B

1002-266X(2017)09-0050-03

2016-11-25)