稀释液中添加L—半胱氨酸对鸡精液室温保存的影响

赵万乐 李艳玲++朱松波 陈二平 +张兆旺

摘要：利用安卡红种公鸡新鲜精液，在A、B等2种稀释液稀释后分别添加不同浓度的L-半胱氨酸，测定精子活率和精子畸形率，比较不同浓度的半胱氨酸对鸡精液在常温保存下的效果。结果表明，在常温下保存，在A稀释液中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸的鸡精液的各项指标值均比不添加和添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的好（P<0.05），且保存效果较为理想。在B稀释液中添加1.0、5.0 mmol/L L-半胱氨酸的精子有效存活时间极显著高于对照组（P<001）；随着L-半胱氨酸添加量的增多，生存指数值变大，且以添加5.0mmol/L L-半胱氨酸最高，但與添加 1.0 mmol/L L-半胱氨酸间差异不显著（P>0.05）。但是，2种稀释液中是否添加L-半胱氨酸对精子畸形率影响不大（P>0.05）。

关键词：稀释液；鸡；精液；L-半胱氨酸；室温保存；精子活率；畸形率

中图分类号： S831.3+2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）03-0131-03

收稿日期：2015-12-25

作者简介：赵万乐（1987—），男，山西晋城人，硕士，研究实习员，主要从事动物繁殖技术方面的研究。E-mail：503587578@qq.com。

[JP2]精液保存会随着时间的推移而使精子活力以及受精能力降低[1]，即使是使用一些比较好的稀释液。精子在呼吸代谢过程中能产生活性氧族（ROS），携带有氧自由基，造成过氧化损伤，这是受精能力下降的重要原因之一。因此，在精液稀释液中添加抵抗自由基的成分是很有必要的[2]。近些年，过氧化作用对精子的不良影响得到研究者的普遍重视，[JP]但是由于物种和抗氧化剂作用机理的不同，抗氧化剂在精液保存中的添加量和作用效果报道不尽相同。本试验根据鸡精液的氧化原理和L-半胱氨酸的作用机理，在稀释液中添加不同浓度的L-半胱氨酸，观察精液在常温下的保存效果，现报道如下。[JP]

1材料与方法

1.1试验动物

选用15羽健康、繁殖性能好的安卡红种公鸡，供采精用。供试验鸡的饲料配方见表1。

1.2试验方法

1.2.1稀释液配方根据试验目的配制2种基础稀释液A、B（表2）各250 mL，然后各取3份，均为30 mL，编号为A0、A1、A2，B0、B1、B2，以A0、B0为空白对照组，然后在控制A、B稀释液渗透压和pH值基本不变的基础上分别向其中添加不同浓度的L-半胱氨酸，制成A1、A2、B1、B2等4种稀释液，其中A1、B1中1.0 mmol/L L-半胱氨酸添加量为 3.6 mg，A2、B2中5.0 mmol/L L-半胱氨酸添加量为 18.2 mg。

1.2.2精液采集用腹背部联合按摩法采集公鸡精液，将采得的鸡精液用纱布过滤，注意在采集过程中减少粪便、血液、尿酸盐等的污染。然后将集精瓶用毛巾包好迅速带回实验室，运送过程中，且尽量避免振荡。

1.2.3精液的稀释和保存分别用稀释液A0、A1、A2、B0、B1、B2在室温下将鸡精液按照体积比1 ∶[KG-*3]3进行稀释，稀释后迅速检查精子活率，然后置于室温（试验进行期间最高室温27 ℃，最低室温24.5 ℃）下进行保存。测定精子生存指数和总存活时间，即每隔4 h观察1次活率，直到精子的活率为0时终止，每个处理重复4次。精子生存指数为相邻2次精子活率平均数与间隔时间乘积的总和，总存活时间为从观察开始至精子活率为0时的累计时间和。此外，本试验结合生产实际情况测定有效生存指数和有效存活时间，即指精子的活率为0.6时的生存指数和精液保存时间。

1.2.4精子畸形率精子畸形率是通过用龙胆紫染液染色后的精液抹片在显微镜1 000倍油镜下观察300个精子中畸形精子所占的比例。分2次观察，第1次为在刚稀释完后即行抹片观察，第2次为等精子全部死亡时。

1.3数据处理

利用Excel 2007对原始数据作初步整理，然后采用SPSS 170生物统计软件包进行统计学分析，差异显著标准为P<0.05。[JP]

2结果与分析

2.1生存指数和总存活时间

试验结果（表3）表明，在添加相同浓度L-半胱氨酸的情况下，用B 稀释液保存鸡精液的精子总存活时间和生存指数均显著高于A稀释液（P<0.05）。就某一个稀释液而言，在A中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸时，生存指数均显著高于不添加和添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸等2个试验组（P<0.05），但总存活时间以添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸最长，且显著长于对照组和添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸试验组（P<0.05）。而在B液中添加1.0、5.0 mmol/L L-半胱氨酸的生存指数显著高于未添加组，且以添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的效果最好（P<0.05），总存活时间表现出与A 稀释液相同的趋势。

2.2有效生存指数和有效存活时间

试验结果（表4）表明，添加相同浓度半胱氨酸的情况下，用B稀释液保存鸡精液的精子有效存活时间和有效生存指数均显著高于A稀释液（P<0.05）。在A稀释液中添加10、5.0 mmol/L 半胱氨酸时，有效生存指数均显著高于对照组（P<0.05），但2组间无显著差异（P>0.05）；有效显存活时间以添加1.0 mmol/L最长，且显著的高于其他2组（P<005）。而在B稀释液中无论是否添加L-半胱氨酸，其有效生存指数差异不显著（P>0.05），但对于有效存活时间来说，添加1.0、5.0 mmol/L均显著高于未添加组（P<0.05）。

2.3保存前后2个时期精子畸形率

本试验将巨型精子、短头精子、双头或双尾精子、顶体膨胀或脱离、精子头部残缺或尾部分离等各种精子异常类型均视为畸形，试验结果（表5）表明，添加相同浓度L-半胱氨酸的情况下，第1次观察用B 稀释液保存的鸡精液时，其精子畸[CM（25]形率显著低于A稀释液（P<0.05），而第2次两者之间差异不显著（P>0.05）。同一种稀释液而言，2种稀释液在不添加L-半胱氨酸和添加1 mmol/L L-半胱氨酸时精子畸形率差异均不显著（P>0.05），第1次观察时A、B等2种稀释液在不添加L-半胱氨酸和添加1 mmol/L L-半胱氨酸时精子畸形率显著低于添加5 mmol/L L-半胱氨酸时的精子畸形率（P<0.05）；第2次观察时，A稀释液精子畸形率差异均不显著（P>0.05），B稀释液在不添加L-半胱氨酸和添加 1 mmol/L L-半胱氨酸时精子畸形率显著低于添加5 mmol/LL-半胱氨酸精子畸形率（P<0.05）。

3结论与讨论

从表3、表4可看出，总的趋势是添加组的保存效果好于未添加组，且添加量或稀释液不同，试验结果也不同。在A稀释液中，生存指数以添加1.0 mmol/L时最高，2个试验组间的有效生存指数无显著差异，但显著高于对照组。说明在精液保存前期（精子活率将至60%以前）L-半胱氨酸浓度对精子机能影响不大，后期会有较大影响，在B稀释液中也表现出类似结果。造成这一结果的具体原因还不清楚，须进一步研究。精子的存活时间和稀释液的氧化还原指数相关，精子在氧化还原指数为0，即在高度无氧的保护液中保存时间最长；在纯氧环境中，精子几乎不能生存，抗游离氧自由基能力很弱。另外，生物氧化、輻射、污染物侵害、细胞内酶促反应等过程中释放的自由基对生物分子，尤其是对脂质和核酸有很大的损伤作用，但保护性酶和抗氧化剂可防止自由基的损害作用[3]。所以，在稀释液中添加含巯基抗氧化剂的一个主要目的就是能够及时清除精子代谢和外界因素产生的自由基，以达到对精子的保护作用。L-半胱氨酸是一种含有巯基的小分子量氨基酸，是细胞间谷胱甘肽（GSH）的前体，极易渗入细胞膜，增强细胞内和细胞外GSH的生物合成，进而清除了自由基而保护了膜内的脂类和蛋白质。精子在常温保存过程中会进行缓慢的呼吸代谢活动而产生活性氧族，所携带的氧自由基氧化性很强，能氧化精子质膜的不饱和脂肪酸，干扰精子的代谢，造成过氧化损伤，这就是精子受精能力下降的重要原因[4]。Ravie等报道，鸡和火鸡精子中含有多不饱和脂肪酰基[5]，而且鸡和火鸡精子的体外保存都起过氧化反应、精子脂质过氧化反应，对精子具有中毒效应[6-7]。Fujihara 等试验发现，脂质过氧化反应会降低精子活率[8]。从对火鸡精子的研究来看，精子中的抗氧化性没有足够高，因此不能够抑制精子脂质过氧化反应，这可以解释本试验中添加L-半胱氨酸后精液的保存效果明显好于不添组。

本试验虽未得出对于A、B等2种稀释液添加L-半胱氨酸的准确量，但随着L-半胱氨酸浓度的增加，保存效果开始变得不明显，但在不同的稀释液中这种变化不同，具体来说，在A 稀释液中添加5 mmol/L L-半胱氨酸时，除总存活时间外其他3个指标均有所下降；B稀释液在同等情况下虽有所上升，但不明显，说明抗氧化剂的添加量只有在合适的浓度下才能发挥效果。Blesbois等试验证明，维生素C浓度低时才具有抗氧化作用，而高浓度的维生素C具有促氧化作用[9]。孙琪证明，在向稀释液中添加2、4 mmol/L 半胱氨酸均能提高猪精子各项指标，更可以维持8 d 60%以上的活率，其中2 mmol/L 半胱氨酸效果更显著，添加8 mmol/L 半胱氨酸效果则较为不明显[10]。覃永长等证明，在250 mL基础稀释液中添加0.1 g（在本试验中相当于3.3 mmol/L）L-半胱氨酸保存猪精液8 d时，精子活率还保持在50%以上[11]。李大吉等在冷冻稀释液中添加1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸+0.1 mg/mL L-半胱氨酸（在本试验中相当于1.0 mmol/L），解冻后猪精子的平均路径速度、平均侧摆幅度和平均鞭打频率最高，运动的线速度最低，但对膜脂质过氧化反应没有影响，但 0.1 mg/mL L-半胱氨酸处理组可以明显降低丙二醛（MDA）含量[12]。虽然有很多试验已经证明L-半胱氨酸可以有效地保护精子，降低精子畸形率，但在本试验中可以看出，是否添加L-半胱氨酸对精子畸形率似乎并没有多大的改变，这可能是由试验条件造成的，精液来源于不同物种以及稀释液溶质。

本试验通过测定鸡精液保存过程中精子的生存指数及有效存活时间可知，在A稀释液中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸效果较好，但添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸时保存效果会有所下降；在B稀释液中添加 1.0 mmol/L L-半胱氨酸与添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的保存效果差异不显著，但均高于空白对照组，这种差异可能是由稀释液的不同造成的。综上可知，在本试验中影响精子体外存活时间和有效存活时间的因素不是某一个因素造成的，B稀释液比A稀释液好，可能是由于B稀释液中某些成分和L-半胱氨酸共同作用才表现出对鸡精液的体外保存效果，可能是增加了抗氧化剂的作用，但具体机制还须要进一步分析。在进行鸡精液体外常温保存时，添加L-半胱氨酸可以明显延长保存时间，但不同浓度保存效果不相同。

[HS2]参考文献：[HJ1.7mm]

[1]Yoshida M. Conservation of sperms：current status and new trends[J]. Animal Reproduction Science，2000，60/61（3）：349-355.

[2]高飞，岳奎忠，杨增明. 猪精液液态保存的研究进展[J]. 中国畜牧杂志，2004，40（6）：46-49.

[3]Rodriguez-Martinez H，Saravia F，Wallgren M，et al. Boar spermatozoa in the oviduct[J]. Theriogenology，2005，63（2）：514-535.

[4]张长兴，陈理盾. 影响猪精液保存时间的因素[J]. 河南畜牧兽医，2001，28（8）：15-16.

[5]Ravie O，Lake P E，The phospholipids～bound fatty acids of fowl and turkey spermatozoa[J]. Anim Reprod Sci，1984，9（2）：189-192.

[6]Fujihara N，Koga O. Prevention of the production of lipid peroxide in rooster spermatozoa[J]Anim Reprod Sci，1984，7（4）：385-390

[7]Cecil H C，Bakst M R. In vitro lipid peroxidation of Turkey spermatozoa[J]. Poultry Sci，1993，72（7）：1370-1378.

[8]Fujihara N，Howarth Jr B.Lipid peroxidation in lowi spermatozoa[J]. Poultry Sci，1978，57（6）：1766-1768.

[9]Blesboid E，Grasseau I，Blum J C. Effects of vitamin E on fowl semenstorageat 4C[J]. Theriogenology 1993，39（3）：771-779.

[10]孙琪.不同抗氧化剂对猪精液常温保存的影响[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2009.

[11]覃永长，张家庆，朱旋，等. 不同类型半胱氨酸对猪精液保存的影响[J]. 养猪，2010（2）：20-22.

[12]李大吉，魏世宝，金一，等. N-乙酰半胱氨酸和L-半胱氨酸对冻融后猪精液品质的影响[J]. 畜牧与兽医，2009，41（9）：42-44.