微卫星DNA技术评估绵羊品种的遗传多样性

侯冠彧+周汉林+王东劲

摘 要 利用30个SSR标记对乌珠穆沁羊、苏尼特羊、内蒙古细毛羊、宁夏滩羊、小尾寒羊和无角多赛特羊6个绵羊品种共237个体进行遗传多样性分析表明： 6个绵羊品种平均期望基因多样度为0.671 1、观察基因多样度为0.565 9、平均多态信息含量为0.596 1； 6个绵羊品种间遗传分化系数为11.74 %；系统发生树将 6个绵羊品种划为4个分支，即苏尼特羊和乌珠穆沁羊、内蒙古细毛羊和小尾寒羊、宁夏滩羊、无角多赛特羊。

关键词 绵羊 ；微卫星DNA ；遗传多样性

中图分类号 S826

Abstract To analyze the genetic diversity through 30 microsatellite loci in Ujumqin （WU） sheep； Sonid （SU） sheep； Inner Mongolia Wool （NE） sheep； Tan （TA） sheep ； Small-Tail Han （XH）sheep and Poll Dorset （PD） sheep breed， the results showed that he expected and observed mean gene diversities were 0.6711 and 0.5659， the mean polymorphism value were 0.5961， gene differentiation are 11.74% in all sheep breeds. The 6 sheep breeds can be sorted with four cluster： Sonid （SU） and Ujumqin （WU） sheep， Small-Tail Han （XI） and Inner Mongolia Wool （NE） sheep， Tan （TA） sheep of Ningxia， Poll Dorset sheep.

Key words sheep ；microsatellite DNA ；genetic diversity

遺传多样性研究是畜禽品种保护和利用的基础性工作，中国绵羊品种在经历了长期的自然选择和人工选择后，大部分绵羊品种遗传多样性水平都发生了一定程度的改变，有的品种甚至灭绝。20世纪80年代初完成的全国畜禽遗传资源普查，列入中国羊品种志的有35个，其中地方品种15个，枣北大尾羊消失。1999年不完全调查表明，兰州大尾羊受到严重威胁，汉中绵羊、青海黑藏羊受较大威胁[1]。2000年农业部列出的78个国家级畜禽保护品种名录中，小尾寒羊、乌珠穆沁羊、宁夏滩羊、同羊、西藏羊、贵德黑裘皮羊、湖羊都在其中。因此，针对中国绵羊品种进行遗传多样性分析则具有一定实际意义。

微卫星DNA是短的串联的简单重复序列（Simple Sequence Repeat简称SSR），广泛分布于生物体的整个基因组。具有数量多、多态性丰富、保守性强、共显性遗传、进化承受选择压力小，操作简单、重复性好和检测结果准确等优点，被认为是品种遗传变异、结构估测和演化历史分析最主要的分子标记之一[2-4]。笔者借助微卫星DNA分析，评估中中国部分地方绵羊品种的遗传变异和群体结构情况，为制定地方绵羊品种的保护和利用策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集

采取典型群随机抽样和品种内亚群定点随机抽样法采集了无亲缘关系的6个绵羊品种共237个体的耳组织样[5]（表1）。

1.1.2 微卫星引物

微卫星DNA引物由网站（http：//www.marc.usda.gov）查得，选择彼此不连锁，遍布大部分染色体的30个位点（表2）。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

DNA提取参照《分子克隆实验指南》（第2版）[6]哺乳动物细胞中分离高分子量DNA的方法。

1.2.2 PCR扩增

PCR反应采用12 μL反应体系，每个反应含有0.2 mmol·L-1 dNTPs，每条引物6 pmol，1 U Taq酶，模板DNA约50 ng，Mg2+浓度1.5 mmol·L-1。本实验PCR反应条件和程序，95预变性5 min，94 ℃变性30 s，50-60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，经33-35个循环，于72 ℃延伸5-10 min。

1.3 统计分析

1.3.1 群体内遗传变异

应用GDA（gene data analysis）软件分析。

（1）平均基因多样度（Average gene diversity）表示群体平均在某微卫星座位为杂合子的比例。参数D为各个位点的平均基因多样度，括号中为基因多样度。D由下式计算：

（2）多态信息含量（polymorphism information content，PIC）是位点多态性高低的一个度量。

1.3.2 群体间的遗传关系

应用DISPAN软件分析

（1）遗传分化系数（Coefficient of gene differentiation，GST），视所有研究群体为一个群体，计算群体间的遗传分化程度。

GST=（DT-DS）/DT

式中DT（Total gene diversity）为总群体基因多样度，DS（Average diversity within each population）为亚群体基因多样度。

（2）遗传距离，Nei氏标准遗传距离[7]，Nei′s遗传同一性（I）：

其中 和 分别是群体1和2的L基因座u等位基因的估计频率。

Nei′s遗传距离（DS）：

DS=-ln（I）

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的PCR扩增

不同引物扩增结果不同。部分电泳图见图1。

2.2 群体内遗传变异

2.2.1 等位基因频率

等位基因频率是估计和比较遗传多样性及计算遗传距离的最基本数据。本实验用于群体分析的30个位点在测定的6个品种中表现出较为良好的多态性，总共检测到284个等位基因。30个位点发现的等位基因数有83 %比报道的少。等位基因分布不均，等位基因最多者为AGLA269，有19个等位基因；最少的是ILSTS021，有4个等位基因。

2.2.2 基因多样度与多态信息含量

根据等位基因频率，利用GDA程序计算了6个绵羊品种的期望基因多样度和观察基因多样度，利用自编程序计算了6个绵羊品种的平均多态信息含量（表3）。由表3可知，内蒙古细毛羊的基因多样度为0.646 5，最高接近期望基因多样度0.676 6，品种志记载内蒙古细毛羊是以蒙古羊为母本，苏联美利奴羊、高加索羊、新疆细毛羊和德国美利奴羊等品种为父本培育而成。因为杂交的结果使基因趋于杂合，其品种形成是几个品种杂交选育的结果，所以基因多样度相对较高。宁夏滩羊的基因多样度最小为0.483 3与期望基因多样度0.695 3相差最大，这可能与毛纺织业的衰落有关，滩羊受市场影响，由原来养殖高峰的500万只锐减至100万只。这在一定程度上影响了滩羊的遗传多样性水平。6个品种平均基因多样度0.565 9和期望基因多样度0.671 1相差0.105 2，说明这六个品种都较原始品种遗传多样性有所降低。乌珠穆沁羊的多态信息含量最高为0.649 1，说明所检测位点在乌珠穆沁羊的变异程度较大。因乌珠穆沁羊长期处在气候恶劣粗放的状态下繁殖，造就了它独特的种质特性。

2.3 群体间遗传分化

2.3.1 遗传分化系数

根据等位基因频率，利用DISPAN程序计算了6个绵羊品种在30个位点的遗传分化程度（表4）。品种内遗传变异分析表明，6个绵羊品种的基因多样度和多态信息含量比较相近，位点值基本在0.5以上，总群体基因多样度为0.634 8。说明6个绵羊品种遗传变异相对比较丰富，选择潜力较大。这与巩元芳等[8]利用RAPD标记分析蒙古羊、湖羊、滩羊、小尾寒羊、乌珠穆沁羊、无角多赛特等绵羊品种得出的遗传多样性水平比较吻合。多年来的引种杂交表明，任何品种在内蒙古特有的环境下，其生长发育都受到严重的限制。蒙古羊靠自身整体优势阻止了外来品种基因入侵，蒙古羊在蒙古高原上的主导地位，是任何其它品种都不可替代的[9]。无角多赛特PIC最低，为0.518 9，属于中度多态。因为国内的无角多赛特大部分都是人工授精的产物，是少数种公羊的后代，所以在微卫星位点上表现出来的差异也较小。群体间遗传变异分析表明：6个品种总群体的平均值是11.74 %，说明6个绵羊品种在30个微卫星座位上的分化程度平均为11.74 %，品種间变异占总群体变异的11.74 %，大部分变异存在于品种内部。BM315位点的GST值最大为0.233 1，说明该位点在6个绵羊品种间的变异程度最大。

2.3.2 群体间遗传距离和系统发生树

基于等位基因频率计算了6个绵羊品种间的Nei位置标准遗传距离（表5），并进一步进行了6绵羊品种的NJ法和UPGMA法聚类（图2）。结果表明：系统发生树中乌珠穆沁羊和苏尼特羊是蒙古羊分化最晚的2只。由于2个品种地理位置、气候条件、饲养方式等都比较接近，受人文环境影响又很类似，加上有些类群长期的无目的杂交育种，最后导致2个群体的同质性增加，遗传距离减小。2个品种的bootstrap百分数为99以上，说明聚类结果比较可靠。小尾寒羊和内蒙古细毛羊的遗传距离为0.362 3，二者在系统发生树中聚在一起，因为2个品种都和蒙古羊有一定的渊源，它们在一定程度上都还继承着蒙古羊的血统。20世纪90年代以来，随着毛纺织业的冷落，内蒙古细毛羊部分一度向肉用方向发展，在这期间小尾寒羊起到了终端父本作用。小尾寒羊与宁夏滩羊遗传距离为0.479 6，除了无角多赛特之外，相较其它3个品种遗传距离是最大的，这与曹顶国等[10]利用RAPD标记分析小尾寒羊和滩羊的亲缘关系结果比较一致。宁夏滩羊以生产二毛皮而著称，在遗传距离检测中，滩羊和乌珠穆沁羊、苏尼特羊、小尾寒羊及内蒙古细毛羊的距离都比较靠近，但在系统发生树中，它始终都是独树一帜，说明宁夏滩羊在大蒙古羊体系下同时具备自己独特的种质特性。无角多赛特是一个引入的肉羊品种，与同属蒙古羊体系的5个绵羊品种分为2支，这与多赛特本身遗传特性、生存地域及引入时间等有很大的关系。

3 讨论与结论

平均基因多样度是两个随机选出的基因不相同概率，是生物进化的基础。一个没有进行过人工选择的群体平均基因多样度越高，则该群体就越接近于一个平衡的自然群体；培育品种基因多样度越高，说明参与引血杂交的品种越多。多态信息含量是等位基因频率和等位基因数变化的函数，是位点变异程度的一个描述。平均基因多样度和多态信息含量数值越大，说明群体内基因一致性越差，变异性越大，选择的潜力也越大。

根据《中国羊品种志》记载，乌珠穆沁羊产于内蒙古锡林郭勒盟东部的乌珠穆沁草原。南宋洪皓著《松漠记闻》中有关羊描述，生鞑靼者，大如驴。尾巨而厚类扇，自脊至尾或重2.5 kg。书中描述的绵羊外形特征与今乌珠穆沁羊基本相似。苏尼特羊产于内蒙古苏尼特左、右旗境内的苏尼特草原，1997年内蒙古自治区人民政府正式命名，和乌珠穆沁羊同属肉脂粗毛羊品种。小尾寒羊属短脂尾羊，是由带入中原的蒙古羊培育而成。据河北《完县新志》记载，绵羊一种以绥远二十家子所产为最良，县人多赴此地购买。有大尾、小尾、黑头、白头数种。大尾者为本地产，小尾者为绥远产。内蒙古细毛羊是1960-1967年以蒙古羊为母本，苏联美利奴羊、高加索羊、新疆细毛羊和德国美利奴羊等品种为父本培育而成，1976年经内蒙古自治区批准为新品种。滩羊属裘皮羊品种，是分布在宁夏的蒙古羊经过长期的自然选择和人工选择形成的著名二毛裘皮羊品种。清乾隆20年《银川小志》记载，宁夏各州，俱产羊皮，灵州出长毛麦穟，狐皮亦随处多产。长毛麦穟是人们对滩羊花穗的形象称呼。无角多赛特是澳大利亚于50年代通过有角多赛特导入雷兰、考力代，经系统选育形成，属短毛肉羊品种。本研究的样本是“八五”期间中国农科院畜牧所由澳大利亚引进[11]。通过进一步从分子水平验证并补充了品种志对以上6个品种的划分，为绵羊遗传资源的开发利用和保护提供了科学依据。

参考文献

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