微离轴干涉显微系统中光学参数的确定

程 伟, 江 超, 薛 亮, 魏春娟, 初凤红

(上海电力学院 电子与信息工程学院, 上海 200090)



微离轴干涉显微系统中光学参数的确定

程 伟, 江 超, 薛 亮, 魏春娟, 初凤红

(上海电力学院 电子与信息工程学院, 上海 200090)

着重分析了微离轴干涉理论,通过自(互)相关理论确定了微离轴干涉中物参角的大小,由此推得干涉条纹的最佳空间频率.通过与传统干涉法的实验结果对比发现,微离轴干涉成像重建精度高.此外,不同直径的细胞应合理选用不同倍率的物镜,有助于提高后期相位重建的准确度,为进一步提高干涉测量的速度和准确度提供了新方法.

微离轴干涉; 共焦显微; 层析; 空间频率

干涉显微层析是一种新的测量生物组织内部三维结构的方法,结合了干涉层析和显微放大技术,既能重构细胞的三维整体结构,又可对细胞内部的微小结构进行放大观察.通过提取干涉条纹的相位信息可反演出由样品引入的光程差,进而重建样品的三维折射率分布[1].该技术常采用He-Ne 激光器作为实验室光源,其相干长度较OCT长,容易产生干涉条纹,并且功率小,对于较薄的透明细胞穿透能力强,能非侵入地观察样品的内部结构,因此在生物学和医学领域有着重要的应用价值.

干涉条纹主要有离轴干涉和同轴干涉两种采集方式.离轴干涉[2]是指参考光与物光成一定角度干涉,只记录一次干涉图就可以用快速傅里叶变换法解包出物体的相位信息,大大减少了机械振动带来的影响,适用于测量动态生物样品,但是离轴干涉要求频谱中0级和±1级谱足够分开来提取有用的+1级(或者-1级)信息,无效带宽增多,并且后期相位重建的误差大.同轴干涉[3]时参考光和物光的夹角为零,在这个条件下,对样品的一次测量至少需要采集3幅图像来提取相位信息,虽然相位的重建精度高,但与离轴干涉测量相比,需要借助额外的元件(如PZT)来进行时间移相,加入噪声的同时也会带来机械振动[4],并且不能对动态生物样品进行测量.

SHAKED N T等人[5]提出了介于两者之间的微离轴干涉法,吸取了离轴干涉和同轴干涉的优点,该方法既优化有用带宽,又避免了机械式移相,保证了后期相位重建的精度.本文着重剖析微离轴干涉系统,给出其光学参数的确定方法,并与传统干涉法进行优劣比较.

1 微离轴的界定

微离轴干涉是指物光和参考光存在微小夹角,将干涉图作傅里叶变换后±1级频谱互相间不重叠但是分别与零级谱有交叠,并且占用带宽最小时的干涉[5].物参角θ的大小,即条纹的空间频率是判断微离轴干涉的唯一标准.

干涉条纹的强度分布可以写成:

(1)

式中:Ik——干涉条纹的强度;Er,Es——参考光场和样品光场的分布;φOBJ——样品引起的相位变化;q——条纹的空间频率,由参考光和样品光之间的夹角决定;

αk——加入λ/4波片后参考光路的相位变化,α1=0,α2=π/2.

设:

(2)

式中:HT——希尔伯特变换.

则有:

(3)

从式(2)和式(3)可以看出,q值是微离轴干涉中最重要的一个参数,必须很精确,否则会给样品相位值的后期重建带来较大误差.本文中通过自(互)相关运算来计算q的值.

计算两光路之间的互相关函数:

(4)

式中:C(ξ)——两光路之间的互相关函数;δ(ω)——冲激函数.

同时,参考光路的自相关函数A(ξ)为:

(5)

由此反推,可得此时的物参角θ为:

(6)

式中:λ——参考光波的波长.

即θ=3°.此时,干涉处于微离轴状态.

2 微离轴干涉与传统干涉法的对比实验及结果分析

2.1 实验过程及结果

实验中,调整物参角拍摄不同载频的干涉图,样品为玻片,结果如图1所示.

由图1可以看出,随着物参角的变大,条纹变密.

图1 不同载频的干涉图

经过相位解包后,结果如图2所示.由图2可以明显看出,微离轴条纹与背景交接处跳变较少,过渡较为平滑.

图2 不同载频的相位包络图

进一步对包络图进行相位提取,结果如图3所示.由图3可以看到,微离轴的重建结果噪声少,很好地反应了样品的原貌,而随着载频的增大,重建结果愈加失真.

2.2 分析与讨论

实验中采集的是样品经显微物镜放大后的干涉图,针对不同放大倍率的显微物镜,表1给出了未经放大的干涉条纹间距.

图3 不同载频的相位重建图表1 不同放大倍率显微物镜对应的条纹间距和分辨率

放大倍率条纹间距/μm分辨率/%4176.87.71070.73.11644.22.62528.31.64017.71.26011.80.91007.1

对于同一样品而言,干涉图里包含的条纹越少,灵敏度越高,条纹的形变越容易测量;条纹越多,条纹上细微的扭曲就会被略去,导致重建的相位准确度不高,所以细胞直径应接近条纹间距,这样加入细胞后条纹的形变最易于测量.如果细胞直径相对条纹过小,条纹的变化不明显,重建精度下降.此外,对于共焦显微而言,物镜的倍率越高,实验的调节难度越大,像差越严重.因此,在细胞直径和条纹间距相当的情况下,不必一味追求高倍率放大物镜.

根据推导,针对不同直径的细胞,应使用不同倍率的物镜.当细胞直径大于50 μm时,对应选用10倍的显微物镜;当细胞直径在30 ～50 μm时,用16倍的物镜;细胞直径在12 ～20 μm时,用40倍的物镜;直径小于12 μm时,用60倍的或100倍的高倍物镜.SHAKED N T等人[5]在实验验证微离轴理论时,样品是直径为12 μm的聚合物,选择了40倍的显微物镜,与我们的结论一致.

3 结 论

(1) 根据互(自)相关理论计算可以得到微离轴状态下的物参角,且物参角越大,干涉条纹越密,由此推得干涉条纹的最佳空间频率.

(2) 通过与传统干涉法的实验对比,发现微离轴干涉重建精度高;并且针对不同直径的细胞,给出了合适的显微物镜的放大倍率,即当细胞直径大于50 μm时,对应选用10倍的显微物镜;当细胞直径在30～50 μm范围内,用16倍物镜;细胞直径在12～20 μm之间,用40倍物镜;直径小于12 μm时,用60倍或100倍的高倍物镜.

[1] XUE Liang,LAI Jiancheng,LI Zhenhua.Determining the optimal imaging position in tomographic interference microscopy[J].Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering,2009,7513:75130Z-75130Z-8.

[2] HUANG D,SWANSON E A,LIN C P,etal.Optical coherence tomography[J].Science,1991(254):1 178-1 181.

[3] CUCHEN E,MARQUET P,DEPEURSINGE C.Spatial filtering for zero-order and twin-image elimination in digital off-axis holography[J].Applied Optics,2000,39(23):4 070-4 075.

[4] YAMAGUCHI I.Phase-shifting digital holography[J].Optics Letters,1997,22(16):145-171.

[5] SHAKED N T,ZHU Y,RINEHART M T,etal.Two-step-only phase-shifting interferometry with optimized detector bandwidth for microscopy of live cells[J].Optics Express,2009,17(18):15 585-15 591.

(编辑 白林雪)

Determination of Optical Parameters in Slightly-off-axis Interference Microscopy

CHENG Wei, JIANG Chao, XUE Liang, WEI Chunjuan, CHU Fenghong

(SchoolofElectronicsandInformationEngineering,ShanghaiUniversityofElectricPower,Shanghai200090,China)

Slightly-off-axis interferometry theory is introduced and the angle between the object and sample path is calculated via the auto-correlation(cross-correlation) theory.According to this special angle,the optimized fringe spacing is introduced.The slightly-off-axis interference system is compared with on-axis and off-axis interferometry,which is good for high resolution.It is concluded that the biological cells with different size should choose the proper micro objective.As a result,it is convenient for the experiment operating and the enhancement of the phase reconstruction accuracy.The above results shed more lights on novel interferometry.

slightly-off-axis interferometry; confocal microscopy; tomography; fringe spatial frequency

10.3969/j.issn.1006-4729.2017.01.007

2016-03-16

薛亮(1986-),女,博士,讲师,江苏南通人.主要研究方向为光与物质的相互作用.E-mail:xueliangokay@gmail.com.

国家自然科学基金(61205081);上海市教育委员会科研创新项目(13YZ102);上海市大学生科技创新项目(201210256026).

Q632

A

1006-4729(2017)01-0030-03