不同组织染色法在周围神经虚拟三维重建中的应用评估

2017-04-26刘小林梁江山

实用临床医药杂志 2017年7期

罗鹏, 张毅, 刘小林, 梁江山, 林阳,周斌, 刘科, 冯啸, 戚剑

(1. 广东省深圳市第六人民医院, 广东深圳, 518052;2. 中山大学附属第一医院, 整形修复外科, 广东广州, 510080;3. 中山大学附属第一医院显微创伤手外科, 广东广州, 510080;4. 广东医学院附属深圳南山医院手足显微外科, 广东深圳, 518052;5. 湖南中医药大学, 湖南长沙, 410007;6. 北京大学第四临床医学院(北京积水潭医院), 北京, 100035)

罗鹏1, 张毅2, 刘小林3, 梁江山1, 林阳1,周斌4, 刘科5, 冯啸6, 戚剑5

目的评估各染色方法在周围神经虚拟三维重建中应用可行性。方法采集临床胫神经标本，将处理好的标本切片分别用Karnovsky-Roots染色、乙酰胆碱酯酶染色、胆碱乙酰转移酶染色和碳酸酐酶染色4种不同染色，拍照观察，评估各染色方法。结果 Karnovsky-Roots和胆碱乙酰转移酶染色部位与背景区域视觉差异明显，而乙酰胆碱酯酶染色和碳酸酐酶染色部位与背景区域视觉差异不明显。Karnovsky-Roots染色步骤最为简单。结论 Karnovsky-Roots法较为适合应用于周围神经虚拟重建。

三维重建; Karnovsky-Roots染色; 乙酰胆碱酯酶染色; 胆碱乙酰转移酶染色; 碳酸酐酶染色

周围神经虚拟三维重建可深入内部获取周围神经信息，对周围神经损伤治疗具有重要的指导意义[1-2]。三维重建的基本前提是得到结构显示良好的连续二维切片图像[3-4]。因此评估现有的神经组织切片染色方法，寻求合适的用于三维重建方法并获取连续的高质量二维图像是很有必要的[5]。乙酰胆碱是胆碱能神经的重要的神经递质，在神经冲动传导中发挥作用。乙酰胆碱酯酶是其水解酶，胆碱乙酰转移酶是其合成酶。已知运动神经，全部副交感神经和小部分交感神经节后纤维属于胆碱能神经，而感觉神经不是胆碱能神经，因此运动神经纤维和感觉神经纤维聚集区域这两种酶分布也有明显的差异[6]。基于此理论基础，常用的神经组织染色法Karnovsky-Roots染色、乙酰胆碱酯酶染色、胆碱乙酰转移酶染色和碳酸酐酶染色。Karnovsky-Root染色利用不同性质神经纤维中乙酰胆碱酯酶的含量和位置差异来判断神经纤维的性质和分布特点[7]。自Karnovsky-Roots染色方法问世以来，国内外研究报道其染色结果图像中不同性质神经纤维特征一致，至今仍是周围神经研究的常用方法。乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶染色利用抗原抗体反应，不仅能够较为特异的显示乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶的分布特点，而且还能在不破坏所用标本切片完整前提下提供相应染色结果的二维图像，是目前周围神经相关研究中运动神经纤维的定性、定位常用的实验方法[8-11]。碳酸酐酶染色结果显示运动神经纤维和感觉神经纤维的染色结果有明显的不同，但该物质在神经中的具体作用，还缺乏明确的理论基础[12-13]。本研究比较分析Karnovsky-Roots染色、乙酰胆碱酯酶染色、胆碱乙酰转移酶染色和碳酸酐酶染色4种常用的染色方法，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1例新鲜自愿捐献的因右股骨远端骨肉瘤截肢的成年男性右下肢踝管部胫神经标本。

1.2 取材方法

胫神经标本于肢体完全离断后2 h内获得，具体操作步骤为：解剖右下肢踝管部取出长约1 cm的胫神经; 修剪神经外膜，去除周围脂肪、肌肉等组织; 将分离的胫神经两端用大头针固定于软木压舌板上，维持其伸展状态; 冷冻包埋剂(OCT)包埋, -80 ℃速冻; 组织标本包埋后，将两端固定的大头针去除，置于-24 ℃的恒温冷冻切片机横断面连续切片，片厚6 μm; 将切片贴于防脱载玻片上，室温下干燥，选取形态完好的切片40张，以备后续染色使用。

1.3 切片分组

将40张标本切片随机分为A、B、C和D组，每组10张切片。A、B、C和D组切片分别采用Karnovsky-Roots染色、乙酰胆碱酯酶染色、胆碱乙酰转移酶染色和碳酸酐酶染色4种不同的染色方法。

1.4 Karnovsky-Roots染色

硫代乙酰胆碱酯酶12.5 mg, 30 mM硫酸铜2.5 mL, 5 mM铁氰化钾2.5 mL, 0.1 M柠檬酸三钠1 mL, 0.1 M磷酸缓冲液16 mL, 0.1 M磷酸氢二钠9 mL, 0.1 M磷酸二氢钾7 mL, 蒸馏水2 mL, 配制染色孵育液。染色步骤为：将标本切片置于孵育液中4℃孵育24 h, 清水洗去多余染液，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 乙酰胆碱酯酶染色

染色步骤为：将标本切片置于3%双氧水中，静置15 min; PBS缓冲液浸洗标本, 3 min/次; 10%山羊血清常温封闭30 min; 1∶400配制兔抗人乙酰胆碱酯酶抗体工作液; 配制的工作液孵育切片, 4 ℃孵育36 h; PBS缓冲液浸洗标本, 3 min/次; 生物素标记的羊抗兔二抗室温孵育1 h; PBS缓冲液浸洗标本, 3 min/次; 辣根过氧化物酶HRP标记的链酶亲和素抗体室温孵育30 min; PBS缓冲液浸洗标本, 3 min/次; 显色工作液DAB显色10～15 min, 清水洗去多余显色液。

1.6 胆碱乙酰转移酶染色

染色步骤为：将标本切片置于3%双氧水中，静置15 min; PBS缓冲液浸洗标本, 3 min/次; 10%山羊血清常温封闭30 min; 1∶400配制兔抗人胆碱乙酰转移酶抗体工作液; 配制的工作液孵育切片, 4 ℃孵育48 h; PBS缓冲液浸洗标本, 3 min/次; 生物素标记的羊抗兔二抗室温孵育1 h; PBS缓冲液浸洗标本, 3 min/次; 辣根过氧化物酶HRP标记的链酶亲和素抗体室温孵育30 min; PBS缓冲液浸洗标本, 3 min/次; 显色工作液DAB显色10～15 min, 清水洗去多余显色液。

1.7 碳酸酐酶染色

0.1 M硫酸钴5 mL, 0.5 M 硫酸3 mL, 1/15 M磷酸二氢钾0.5 mL, 蒸馏水充分溶解定容至8.5 mL, 配制染液A; 碳酸氢钠380 mg, 蒸馏水充分溶解定容至20 mL, 配制染液B。使用前将染液A和染液B等比例混合震荡4 min, 静置4 min, 1 500 r/min离心4 min备用。

染色步骤为: 4%多聚甲醛固定标本切片, 30 min; 梯度蔗糖过夜; 用混合后的A、B液对切片常温染色, 4～12 min。0.01 M磷酸氢二钠溶液浸洗标本, 1～3 min/次; 2%～3%硫化铵溶液液显色1～2 min; 清水洗去多余浮色后, 0.01 M醋酸溶液浸洗切片。

1.8 染色结果观察和图像获取

使用正立显微镜(DM 2500B)观察不同染色标本的染色结果，比较标本的纹理特征。每张切片随机选取5个视野(×100)进行显微摄像，图像保存为TIFF格式。摄像参数设置: ISO值设定为200, 光圈设定为8, 焦距37.15 mm, 曝光补偿为0, 图像大小2591 ×1938像素，分辨率300 dpi。

2 结果

2.1 Karnovsky-Roots染色结果

100倍光学显微镜下观察Karnovsky-Roots染色结果并拍照，整体观察呈棕黄色的着色部位与背景区域视觉差异明显。其中呈棕黄色的部位显示具有乙酰胆碱酯酶活性，分散的棕黄色色斑构成神经束区域，神经束膜、神经束间结缔组织不着色。而不同性质的神经纤维所呈现的色斑特性有所差异。运动神经纤维色斑形状为较规则的椭圆形，染色较浅，成群排列; 感觉神经纤维不着色; 交感神经纤维色斑形状为不规则着色，分散在感觉神经纤维间，着色较深，成群排列。见图1。

2.2 乙酰胆碱酯酶染色结果

100倍光学显微镜下观察乙酰胆碱酯酶染色结果并拍照，整体观察呈蓝色的着色部位与背景区域视觉差异不明显。其中具有乙酰胆碱酯酶活性的部位染色为蓝色，神经束间结缔组织无特异着色，神经束膜呈蓝色。不同性质的神经纤维色斑聚集分布，髓鞘轮廓着色较浅，运动神经纤维轴索部位着色为蓝色，感觉神经纤维轴索不着色，交感神经纤维色斑位于髓鞘外。见图2。

黑色箭头指示运动神经纤维色斑,白色箭头指示交感神经纤维色斑图1 Karnovsky-Roots染色结果图像 100倍

黑色箭头指示运动神经纤维色斑,白色箭头指示交感神经纤维色斑图2 乙酰胆碱酯酶免疫组化染色结果图像 100倍

2.3 胆碱乙酰转移酶染色结果

100倍光学显微镜下观察胆碱乙酰转移酶染色结果并拍照，整体观察呈棕黄色的着色部位与背景区域视觉差异较明显。其中呈棕黄色的部位显示具有胆碱乙酰转移酶活性。神经束膜、神经束间结缔组织均呈棕黄色染色，神经束区域由分散的棕黄色色斑构成。运动神经纤维轴索部位呈棕黄色着色，感觉神经纤维轴索不着色，交感神经纤维色斑位于髓鞘外。见图3。

2.4 碳酸酐酶染色

100倍光学显微镜下观察胆碱乙酰转移酶染色结果并拍照，整体观察灰黑色着色部位与背景区域视觉差异不太明显。其中呈灰黑色的部位显示具有碳酸酐酶活性。神经束膜呈灰黑色着色，着色较浅，神经束间结缔组织呈现不均匀的浅灰色。同时还可观察到髓神经纤维髓鞘轮廓着色，而髓神经纤维轴索部分着色，部分观察不到着色。见图4。

黑色箭头指示运动神经纤维色斑,白色箭头指示交感神经纤维色斑图3 碱乙酰转移酶免疫组化染色图像 100倍

黑色箭头指示轴索着色的有髓神经纤维,白色箭头指示轴索未着色的有髓神经纤维图4 碳酸酐酶染色结果图像 100倍

2.5 各组染色方法比较

分别从染色时间、染色步骤和显色阶段是否需人工监督3个方面对Karnovsky-Roots染色、乙酰胆碱酯酶染色、胆碱乙酰转移酶染色和碳酸酐酶染色4种染色方法进行比较。各组染色方法比较结果见表1。

表1 各组染色方法比较

其中Karnovsky-Roots染色步骤最为简单，并且显色阶段无需人工监督。染色时间为24～36 h; 胆碱乙酰转移酶染色步骤繁琐，染色时间最长，为50～52 h, 并且显色阶段需人工监督; 乙酰胆碱酯酶染色步骤虽然繁琐，但染色时间较胆碱乙酰转移酶染色方法短，为38～40 h, 同样显色阶段也需人工监督; 碳酸酐酶染色染色步骤较简单，并且染色时间最短, 2～3 h即可完成染色，显色阶段需人工监督。

3 讨论

周围神经虚拟三维重建是将组织学与解剖学结合起来的有效途径[1-2, 14]。周围神经虚拟三维重建的目的是再现神经内部空间结构。高质量的二维图像是三维重建的重要基础。周围神经虚拟三维重建，需要二维图像中明确显示神经束和神经纤维的分布，因此，所需要的图像需具有较强的纹理特征[15-17]。本研究提示，Karnovsky-Roots染色区域和背景区域区分明显，但是图像中各性质的神经纤维纹理特征差异不明显。而乙酰胆碱酯酶染色和碳酸酐酶染色部位与背景区域视觉差异不明显。Karnovsky-Roots染色结果中，只有乙酰胆碱酯酶分布区域着色，神经束膜、神经束间结缔组织不着色，因此乙酰胆碱酯酶着色部位形成的棕黄色色斑与背景间的视觉差异明显[18-20]。色斑主要分布在运动神经纤维和交感神经纤维轴索位置，两种神经纤维的特征色斑有较明显的视觉差异，与国内外研究中人体标本的染色结果是一致的。乙酰胆碱酯酶染色和胆碱乙酰转移酶染色过程中会有明显的有非特异染色。乙酰胆碱酯酶染色的非特异染色主要显示为同阳性部位颜色接近的色斑，有许多色斑与阳性部位形状接近，肉眼不易区分，会影响准确分析神经束功能性质; 胆碱乙酰转移酶染色中，不仅有非特异着色色斑，神经束膜同神经束间结缔组织着色接近，不易从图像中准确辨识神经束区域和不同性质神经纤维分布特点[21-23]。碳酸酐酶染色结果图像中，有髓神经纤维的髓鞘普遍着色，呈浅灰色，碳酸酐酶阳性部位位于部分有髓神经纤维轴索位置，神经束膜着浅灰色，与髓鞘颜色接近，神经束间结缔组织基本不着色。各部分组织结构的视觉差异小。研究[24-25]证明，不论是使用动物标本，还是使用人周围神经标本，在碳酸酐酶染色结果中，并不是所有的感觉神经轴索着色，也有部分运动神经纤维轴索着色，而且着色的神经纤维无明确可供区分的特征，难以准确区分。

在4组染色的过程中, Karnovsky-Roots染色步骤最简便，只要将孵育液按比例配置，放置于4 ℃环境中，将标本完全浸入孵育液24 h, 就可以得到比较满意的结果。由于过程中不需要标本反复出入染液，因此很少出现标本的破损和脱落，且适合大量切片同时染色，有利于保持图像中纹理、颜色等一致。

乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶的免疫组化染色以及碳酸酐酶染色步骤较为繁琐，染色过程中必需由操作者严密观察显色步骤，避免背景颜色过深，影响对识别图像中的感兴趣区域。为了减少染色过程中出现的非特异着色干扰对染色结果的判断，需要适度洗涤染色后的切片，洗涤过程也许操作者严密观察洗涤效果，避免过度洗涤造成切片组织破损和着色的阳性部位脱色。

综上所述，通过比较可以看出, Karnovsky-Roots染色鉴别神经纤维功能性质的理论依据最为充分，图像纹理特征最易辨识，而且操作过程最为简单，适合大量切片同时染色，但实践显示，该染色后图像不能使用现有图像分析软件进行图像分割，也不适合开发相应图像分析软件，因此还需要改良染色结果，使之适合用于周围神经虚拟三维重建。

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Evaluation of different histochemical staining in three-dimensional reconstruction of peripheral nerves

LUO Peng1, ZHANG Yi2, LIU Xiaolin3, LIANG Jiangshan1, LIN Yang1, ZHOU Bin4, LIU Ke5, FENG Xiao6, QI Jian5

(1.TheSixthPeople′sHospitalofShenzhen,Shenzhen,Guangdong, 518052; 2.DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,TheFirstHospitalAffiliatedtoZhongshanUniversity,Guangzhou,Guangdong, 510080; 3.DepartmentofMicrosurgicalHandSurgery,TheFirstHospitalAffiliatedtoZhongshanUniversity,Guangzhou,Guangdong, 510080; 4.DepartmentofHandandFootSurgery,ShenzhenNanshanHospitalAffiliatedtoGuangdongMedicalCollege,Shenzhen,Guangdong, 518052; 5.HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha,Hunan, 410007; 6.TheFourthClinicalMedicalCollegeofPekingUniversity,BeijingJishuitanHospital,Beijing, 100035)

Objective To explore the feasibility of different histochemical staining in three-dimensional reconstruction of peripheral nerves. Methods The samples were collected from fresh adult common tibial nerve, which were serially horizontally sliced with the thickness of 6 (m. All slices were randomly divided into four groups with different staining such as Karnovsky-Roots staining, acetylcholinesterase staining, acetyltransferase staining or carbonic anhydrase staining. The stain characteristics in various stain phrases were observed under optic-microscope.Results The character of nerve fibers could be distinguished clearly by Karnovsky-Roots, acetylcholinesterase, acetyltransferase and acetyltransferase staining. It took 50 to 52 hours to finish the staining by using Karnovsky-Roots staining. Carbonic anhydrase staining was the simplest method. Conclusion Among the four staining methods, Karnovsky-Roots staining is suitable for three-dimensional reconstruction of peripheralnerves.

peripheral nerves; three-dimensional reconstruction; Karnovsky-Roots staining; acetylcholinesterase staining; acetyltransferase staining; carbonic anhydrase staining

2017-02-05

广州省深圳市南山区科技计划项目(2014028)

戚剑

R 651.3

1672-2353(2017)07-059-05

10.7619/jcmp.201707016