宜春市2015年麻疹病毒野病毒感染病例的快速鉴别

张红波，莫尚鹏，陈玉红，罗维，熊英，龚甜，徐烨

(1、宜春市疾病预防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民医院，江西宜春336000)

宜春市2015年麻疹病毒野病毒感染病例的快速鉴别

张红波1，莫尚鹏1，陈玉红1，罗维1，熊英2，龚甜2，徐烨3

(1、宜春市疾病预防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民医院，江西宜春336000)

目的引进并运用逆转录多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析方法（RT-PCR-RFLP方法）快速鉴别2015年宜春市麻疹野病毒感染病例与疫苗株病毒引起的相关麻疹病例。方法运用realtime RT-PCR对宜春市400例疑似麻疹病例咽拭子标本进行麻疹病毒核酸检测，引进RT-PCR-RFLP方法对麻疹病毒核酸检测阳性咽拭子标本进行检测是否含有AflⅡ酶切位点（疫苗株病毒有，野病毒没有）鉴别疫苗相关麻疹病例。结果麻疹病毒核酸检测阳性标本为9例，阳性率为2. 25%；9例麻疹病毒核酸检测阳性标本RT-PCR-RFLP方法检测的结果为均未能被AflⅡ酶切开，为麻疹野病毒感染。结论成功引进和建立宜春市麻疹野病毒感染病例与疫苗株病毒引起的相关麻疹病例的RT-PCR-RFLP快速鉴别方法，并鉴别了2015年宜春市9例麻疹病例均由麻疹病毒野病毒感染引起。

麻疹野病毒；麻疹疫苗株病毒；逆转录多聚酶链式反应；限制性片段长度多态性分析方法

麻疹是一种传染性很强的呼吸道传染病，严重危害儿童健康，随着麻疹减毒活疫苗(Measles At-tinuated Live Vaccine，MV)的广泛使用，麻疹的发病得到了有效的控制[1，2]。在广泛使用麻疹减毒活疫苗（Measles Attenuated Live Vaccine）后，麻疹在世界大多数地区得到了成功的控制；因此，麻疹也已被世界卫生组织（WHO）列为继全球消灭天花和即将消灭脊髓灰质炎之后下一个拟被消除的传染病。加强适龄儿童含麻疹成分疫苗（Measlescontaining Vaccine，MCV）高水平的接种率，是实现消除麻疹目标的首要措施。接种MCV后，由于疫苗本身的特性和机体个体差异的原因，会出现疫苗接种后反应，如发热、皮疹；甚至出现减毒活疫苗引起的疫苗相关麻疹病例（Vaccine associated Measles Case，VAMC）这些少数个体因接种MV出现的麻疹样临床反应，这与麻疹野病毒引起的不典型麻疹病例在临床上难以区分。为了提高本市麻疹实验室诊断水平，及时对本市VAMC进行鉴别，本实验室引进本省省级麻疹实验室建立逆转录多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析方法（RT-PCR-RFLP方法）[3]对本市2015年麻疹实验室的监测工作发现的麻疹样病例是否由麻疹野病毒感染引起的病例或由接种疫苗引起的疫苗相关麻疹病例进行快速鉴别，现将研究具体情况进行分析报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集根据2013年版的《全国麻疹监测方案》[4]要求采集麻疹暴发和（或）散发疫情麻疹疑似病例咽拭子标本，咽拭子标本保存在3ml麻疹病毒标本运输液(含5%牛血清、终浓度2000U/ml青霉素、200μg/ml链霉素和25U/ml制霉菌素的细胞培养液)中，冷藏运送。

1.2 麻疹病毒核酸检测

1.2.1 病毒RNA提取取病毒培养物200μl，采用Qiagen公司的Reansy Mini kit（Cat No：74106）提取病毒RNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.2.2 realtime RT-PCR检测采用ABI公司生产的AgPath-ID(TM)One-step RT-PCR Kit（Cat No：1005）进行反应体系配制，总体积为25μl，相关操作按照试剂盒说明书进行。反应条件：46℃10min，95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃延伸45s，（收集荧光信号），共45个循环。反应在美国ABI荧光PCR仪7300进行。麻疹病毒引物和探针参照文献[5]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体序列如表1。

表1 麻疹病毒Realtime RT-PCR引物和探针碱基序列

1.3 RT-PCR-RFLP方法鉴别VAMC

1.3.1 RT-PCR反应体系和步骤引物为包含AflⅡ酶切位点（CTTAAG)的麻疹病毒H基因部分片段，上游引物：5'CTCAATCGAGCATCAGGTCA3'，下游引物：5'TACATTCCCTGGGACGTCAT3'。由上海生工合成，扩增产物大小为438bp。

采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit试剂盒（Cat No：210212），进行逆转录扩增，反应体系50μl，其中5×Buffer 10μl、10mmol/L dNTP 2μl、Enzyme Mix 2μl、RNA酶抑制剂（40U/μl)0.25μl、上下游引物（50μmol/L)各0.5μl、无RNA酶水29.75μl、RNA模板5μl。反应条件：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循环如下：94℃30s，50℃30s，72℃1mins，30次循环，72℃10min。

1.3.2 限制性片段长度多态性分析方法[3]取Realtime RT-PCR检测麻疹病毒核酸阳性标本RTPCR产物10μl、1μl AflⅡ酶（Takara公司Cat No：1236A）和2μl Buffer于EP管中，并设对照管：10μl PCR产物；阳性对照为麻疹风疹联合减毒活疫苗（北京天坛生物生物制品股份有限公司，Lot No：201501007）置于37℃水浴1h。将经37℃水浴1h后的对照管和酶切管中的PCR产物在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果

2.1 麻疹病毒核酸检测结果和病例特征分析

2.1.1 麻疹病毒核酸检测结果2015年共检测麻疹疑似病例咽拭子标本400例，其中麻疹病毒核酸阳性标本9例，阳性率为2.25%。

2.1.2 病例特征分析时间分布主要集中在5月、6月份、8月份和11月份。人群分布：男性6例、女性3例；年龄主要分布在小年龄组8月龄～2岁龄组（7例），最小发病年龄为8月龄，最大为23岁。麻疹疫苗免疫史：无含麻疹成分疫苗（MCV）免疫史5例，免疫史不详1例，免疫史不详的比例与年龄没有明显相关性。

2.2 RFLP方法鉴别麻疹病毒疫苗株与野毒株结果9例麻疹病毒核酸阳性标本PCR产物和对照管均为被AflⅡ酶切开，呈单一条带，分子量438bp（见图1、图2），提示此9例毒株均为麻疹病毒野毒株。疫苗代表株（Shanghai-191株）被AflⅡ酶切开为2个片段（分别为287bp、151bp）。

图1 RFLP方法鉴别麻疹病毒疫苗株与野毒株结果

3 讨论

麻疹是儿童最常见的急性呼吸道传染病之一，其传染性很强，在人口密集而未普种疫苗的地区易发生流行，2～3年一次大流行。麻疹病毒通过呼吸道分泌物飞沫传播。临床上以发热、上呼吸道炎症、眼结膜炎及皮肤出现红色斑丘疹和颊黏膜上有麻疹黏膜斑，疹退后遗留色素沉着伴糠麸样脱屑为特征。常并发呼吸道疾病如中耳炎、喉-气管炎、肺炎等，麻疹脑炎、亚急性硬化性全脑炎等严重并发症。目前尚无特效药物治疗。

图2 RFLP方法鉴别麻疹病毒疫苗株与野毒株结果

我国自1965年，开始普种麻疹减毒活疫苗后发病显著下降。目前宜春市儿童免疫首剂接种使用麻疹风疹联合减毒活疫苗(Measles and rubella combinedattenuated live vaccine，MR)，复种使用麻疹流行性腮腺炎风疹联合减毒活疫苗。麻疹减毒活疫苗虽已证明是高免疫性、安全有效的疫苗，由于疫苗本身的特性和机体个体差异的原因，大约2%的受种者可出现暂时性皮疹[6]，部分会发生减毒活疫苗引起的疫苗相关麻疹病例（Vaccine associated Measles Case，VAMC）。麻疹减毒活疫苗的广泛使用后，麻疹野病毒引起的病例会越来越少，2015年宜春市麻疹病毒核酸检测阳性率仅为2.25%，阳性率较低，可能是因为在疫苗时代的麻疹野病毒感染临床表现缺少典型性，根据《全国麻疹监测方案》[4]采集的疑似麻疹病例可能有部分是由其它病原引起的发热出疹性疾病，在临床症状上不易鉴别。随着麻疹减毒活疫苗使用与麻疹消除工作的进程，疫苗株引起的麻疹样病例也会逐渐增多。2013年，国务院《卫生事业发展“十二五”规划》提出了要努力实现消除麻疹的目标[7]，科学、正确、及时地鉴别麻疹疫苗株病毒，对努力实现消除麻疹目标是非常重要的。

本研究成功引进江西省省级麻疹实验室建立的疫苗相关麻疹病例RT-PCR-RFLP快速鉴别方法，并且对2015年江西省宜春市9例疑似麻疹病例咽拭子标本进行鉴定，鉴定的结果为麻疹野毒株引起的麻疹病例。

通过引进疫苗相关麻疹病例RT-PCR-RFLP快速鉴别技术，提高了本市麻疹实验室诊断鉴定水平，并加强了我市麻疹样病例实验室的监测工作的能力。运用疫苗相关麻疹病例RT-PCRRFLP快速鉴别技术可以更加及时地指导我市麻疹防控工作，及时区分麻疹野病毒感染病例和麻疹疫苗株病毒引起的相关病例，为我市麻疹预防与控制工作提供科学依据。

【致谢】感谢江西省疾病预防控制中心疾病控制检验所对本研究的大力支持。

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Rapid identification of nine wild measles virus strains in 2015，Yichun City

ZHANG Hongbo，MO Shangpen，CHEN Yuhong，et al.Center for Disease Control and Prevention，Yichun Jiangxi，336000，China.

Objective To establish and apply reverse transcription polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis(RT-PCR-RFLP method)for rapidly identifying wild measles virus strains and vaccine strains in Yichun City in 2015.Methods The RT-PCR assay was used to detect cases of suspected measles cases throat swab specimens for the virus nucleic acid detection.RT-PCR-RFLP was adopted to identify wild strains and vaccine strains by determining the existence of enzyme-containing AflⅡrestriction site(vaccine strains，not wild strain).Results Nine cases of positive measles virus specimens were detected，accouting for 2.25%.RT-PCR-RFLP identification result was as follows：The strain showed a single band，which means it can not be digested by AflⅡ.Conclusion A method for rapid identification of Yichun City of wild measles virus strains and vaccine strains was introduced，and identified nine cases of Yichun City in 2015 suspected measles cases caused by wild measles virus infection.

Measles wild virus；Measles vaccine strain virus；Reverse transcription-polymerase chain reaction；Restriction fragment length polymorphism

R511.1，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0199-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.019

2016-07-22；

2017-03-10)

张红波，男，1984年生，学士学位，主管技师，主要从事微生物及病毒的实验室监测工作

莫尚鹏，男，1977年生，学士学位，主管技师，主要从事微生物及病毒的实验室监测工作。E-mail：233270758@qq.com