应用Cocktail探针药物法分析中药对CYP450酶活性影响的研究进展

杜犀+何新+黄宇虹+李自强

[摘要] Cocktail探针药物法作为一种快速、准确、高通量的评价CYP450酶活性的研究方法广泛应用于药物研发早期筛选、药物代谢途径及机制研究、药物相互作用研究、指导临床合理用药、上市药物再评价及协助肝肾病理研究等诸多领域。该文对Cocktail探针药物法的特点做简要说明，着重介绍其在中医药领域内的应用进展，从中药活性成分的代谢机制研究，炮制过程，方剂配伍对CYP450的影响，揭示中成药CYP450代谢特点规律，民族药学应用情况，中药保肝作用及中医证候模型研究等，并总结归纳现有研究成果，比较其在中西医药领域内应用的异同点，为该领域的深入研究工作提供参考。

[关键词] Cocktail探针药物法；细胞色素P450酶；中医药；代谢

[Abstract] Cocktail probe substrates approach is a fast，sensitive and high through put method to determine cytochrome P450 enzymes activity. It has been widely used to screen early drug development，analyze drug metabolism types and confirm the metabolism pathways，study drug-drug interactions，optimize clinical regimen，evaluate post marketing drugs and help liver/kidney pathological studies. This article reviewed characteristics of Cocktail probe substrates，focused on the application to traditional Chinese medicine to CYP450 system as follows： the metabolic pathway research of Chinese herb active ingredients；processing way and compatibility of medical herbs affect CYP450；find out the metabolic characteristic of Chinese patent medicine，study in pharmacy of national minority；do research in liver protective effect of traditional Chinese medicine and evaluate traditional Chinese medicine syndromes in animal models. This article make a summary of existing research results and also make a comparison of cocktail probe substrates approach application to western medicine and Chinese medicine.

[Key words] Cocktail probe substrates approach；cytochrome P450；traditional Chinese medicine；metabolism

doi：10.4268/cjcmm20162410

肝脏细胞色素 P450（CYP450）是肝脏微粒体混合功能氧化酶系的主要成分，是一组由许多同工酶组成的超基因大家族，具有遗传多态性，承担着大部分内源性、外源性化合物在生物体内的Ⅰ相转化作用，对药理学和药物代谢的研究具有重要意义。早在20世纪90年代初，Breimer等[1]首次提出使用多个探针药物同时评价多种CYP450同工酶活性的方法，即Cocktail探针药物法：同时给予多种相对低剂量的探针药物，应用现代仪器分析技术测定生物样本中各探针药物的代谢率或代谢分型指标，以获取多个CYP450 同工酶表型信息的方法。该法具有高通量、高准确性、经济简便的特点，在药物研发早期筛选、药物代谢途径及机制研究、药物相互作用研究、上市药物再评价及疾病对CYP450同工酶表型影响、改变药物代谢特点等领域均有重要应用价值。现本文将对Cocktail探针药物法的特点做简要说明，将其在中医药领域内的研究进展进行综合论述，并对其在中西医药领域内应用的异同点进行比较说明。

1 Cocktail探针药物法特点

传统的探针药物研究法已成熟应用于各种CYP450同工酶的表型及活性研究，但是单次探针实验仅能反应单一亚型同工酶的活性特点，且存在的个体差异会导致数据的波动，不利于实验研究，而Cocktail法则可以通过一次实验获取多个CYP450同工酶的表型信息，具有快速、准确、经济、高通量的特点，具有良好而广阔的应用前景。

药物进入生物体内，大部分通过CYP450酶系进行生物Ⅰ相转化，同时也影响着同工酶的活性及表达水平。通过转化后，活性药物可能代谢失活，而前体药物则可能转化成具有活性的代谢产物，在此过程中药物有可能对CYP产生抑制或诱导的作用，诱导会加速药物代谢失活，而抑制作用会减慢药物代谢从而导致药效增强，对CYP450酶系的诱导及抑制作用也是引起药物相互作用的重要原因。2000年Basal会议及2012年FDA《药物相互作用研究指南》推荐的体内研究CYP450同工酶敏感底物、抑制剂及诱导剂见表1[2-3]。

现代仪器分析技术与Cocktail法联用，使方法学的开发更加精准、便捷、高通量。Peng Y等[4]开发了使用LC-MS/MS同时测定针对人肝微粒体9种CYP450同工酶（1A2，2A6，2B6，2C8，2C9，2C19，2D6，2E1，3A4）的16种Cocktail探针药物针的方法，多重探针药物的应用解决了多重底物结合及底物依赖性抑制的现象。Donzelli M等[5]开发了市场化的Basel Cocktail探针药物试剂盒，包含16种低剂量的探针药物组合：咖啡因、依法韦仑、氯沙坦、奥美拉唑、美托洛尔、咪达唑仑，可以同时、快速检测CYP1A2，2B6，2C9，2C19，2D6 和3A4在血浆、唾液和干血点样品中全部的基因型和药代動力学类型。和凡等[6]使用LC-MS/MS系统快速筛查了33 种黄酮类化合物对 CYP450 6 种同工酶的抑制作用，发现黄酮苷类无抑制作用，苷元类对1A2有抑制作用，对3A4有诱导作用。以上研究皆说明国内外Cocktail法的相关研究基础良好，在方法开发及获取数据方面具有独到优势，有利于药物代谢过程、相互作用等的研究。

2 Cocktail探针药物法在中医药领域内的应用

祖国医学博大精深，源远流长，是传统文化的瑰宝，历经数千年的临床考验而不倒，但由于中药调和而成，组分复杂，作用靶点多，如何利用现代的科学手段明确阐述中药的药理作用和代谢过程成为当今中药研究的重点与难点。Cocktail探针药物法对于评价肝 CYP450 酶系对中药进行整体化的代谢物性质、药物相互作用研究、药物代谢表型分析及临床给药方案调整与评估，正与中医中药的整体辩证观不谋而合，其对中医药现代化研究的应用价值不容忽视。目前应用Cocktail法对中医药的研究主要集中在下几个领域：①中药活性成分的代谢机制研究；②中药不同炮制过程对CYP450的影响；③方剂配伍对CYP450活性的影响；④中成药的CYP450代谢特点研究及药物相互作用提示；⑤应用于民族药学研究；⑥中药保肝作用研究；⑦中医证候模型研究。本文也将从上述7个方面来梳理总结现有的研究成果。

2.1 中药活性成分的代谢机制研究 中药活性成分是新药开发的重要来源，随着技术手段的更新发展，研究者对中药活性成分的药理、毒理及药效机制的研究越发深入。Cocktail法用于快速筛选考察中药活性成分的肝药酶代谢特点，对于药物的代谢特点、毒副反应的产生机制及潜在的药物-药物相互作用起到一定的提示作用。现有研究结果中常见中药活性成分的CYP450酶代谢特点见表2。

2.2 不同炮制过程对CYP450的影响 不同的炮制过程会改变中药的性味归经，从而发挥不同的药效。现代学者运用Cocktail法从肝药酶角度分析生药及炮制品或不同炮制过程所带来的代谢特点上的差异，为解释其炮制机制及临床用药安全提供证据。现有的关于生药炮制的CYP450代谢特点见表3。通过表中文献提示，经过炮制后或者不同炮制过程的制药与生药之间，CYP450酶的代谢特点确实出现了不同的变化，从这个角度或可解释生药经炮制后减毒增效的机制。

2.3 药对配伍及传统经方对CYP450活性的影响 中药配伍应用是体现中医理论和“辨证论治”思想的重要载体。探索中药配伍规律及其內在联系，对阐明中药复方的作用机制是必不可少，是中药复方研究领域亟待解决的关键问题。中药素来有“十八反、十九畏”等配伍禁忌，同时，在既往研究中发现，经过复方配伍后，药效指标成分的体内药动学行为及反映的药效与原单方药物相比确会出现明显的改变，这一过程必然涉及到体内代谢、转运的过程。药物代谢酶可能是方剂配伍规律研究的突破点之一，应用Cocktail法研究中药复方对CYP450酶影响的规律也成为近年来的研究热点。目前药对配伍及经方的肝药酶研究进展见表4。现有研究通过CYP450酶的代谢特点发现，“十八反、十九畏”的药对配伍共同作用后，确实有增强抑制/诱导某个或某几个同工酶的作用，这也可能就是造成其代谢滞留产生毒性/促进代谢降低毒性的原因。王宇光[57]探讨了基于CYP450酶的“十八反”配伍的中药相互作用，研究中揭示了瓜萎、白及、半夏、贝母与乌头合用按作用强度顺序对CYP3A和CYPIA2在基因、蛋白和酶活性水平均产生不同程度抑制作用，并通过代谢产物的鉴定和分析，表明可能正是由于对CYP3A和CYPlA2的抑制作用减缓了乌头碱的代谢速率并提高了其血药浓度，从而造成毒性的蓄积，也正是配伍禁忌所在；丹参、苦参、人参及其与藜芦合用后均不同程度的抑制了P450酶含量和主要的药物代谢酶CYP3A及CYP2EI的酶活性，提示可能正是由于3种中药与藜芦配伍后对药物代谢酶的抑制作用减缓了剧毒中药藜芦中相关物质的代谢，导致毒性增加，应和“诸参辛芍叛藜芦”；“藻戟遂芫具战草”，主要是由于甘草具有诱导CYP3A的代谢特点，导致与其合用时海藻、大戟、甘遂、芫花的加速代谢。

2.4 中成药的CYP450代谢特点研究 随着疾病谱的改变和卫生保健需求的日益增长，中医药产业快速发展，特别是中成药临床应用越来越广泛，名优中成药的二次开发成为当前开展重大新药创制的主要途径之一，也是关乎我国民生和经济发展的重要问题之一。临床定位清晰是用药安全和用药有效的首要解决问题。我国研究者进行了多种中成药的肝药酶研究，旨在阐明中成药的代谢特点，指导临床合理用药，避免毒性较大药物相互作用。现有研究中常见中成药的CYP代谢特点见表5，为临床合理用药提供依据。

2.5 Cocktail法在民族药学中的应用研究 王辉[82]对傣药“雅解沙把”增强肝脏解毒功能的机制进行研究探讨，通过给予“雅解沙把”后小鼠洋地黄毒苷LD₅₀增大，用药后戊巴比妥钠对正常小鼠和肝损小鼠睡眠时间缩短，通过Cocktail法考察服用“雅解沙把”后大鼠的肝药酶活性，发现其对于CYP3A4及2A1有诱导作用，可以加速药物、毒物等的代谢转化，从药理层面上解释傣药“雅解沙把”增强肝脏解毒的机制。段雅彬等[83]分析了藏药余甘子对大鼠CYP2C9酶活性的影响，对照组与试验组结果无统计学差异，说明藏药甘余子不主要经由CYP2C9代谢，对其活性无明显影响。崔雅萍等[84]进一步扩大了藏药余甘子的肝药酶研究，通过Cocktail法研究其鞣质部位对大鼠肝微粒体CYP3A4，2D6，2A6，1A2，2E1，2C9亚酶活性的影响，发现其鞣质部位对肝P450 酶活性影响的IC₅₀均较大，证明其对肝药酶的活性影响较小，合并用药时从代谢酶角度较为安全，不易发生药物相互作用。头花蓼是贵州苗药，具有清热解毒、利尿通淋之功，Zheng L等[85]通过Cocktail法考察了头花蓼对大鼠体内CYP1A2，2C9，2C19，2E1及3A4的代谢影响，发现其能诱导大鼠CYP2C9及3A4，提示其可能会加速与其合用药物的代谢，在临床应用中需考虑可能发生的药物相互作用。

2.6 中药保肝作用研究 邱萍等[86]选用KM雄性小鼠分组灌胃给予不同剂量复方银杏叶制剂（GCB）、银杏叶提取物（GBE）及联苯双酯连续8周，再以白酒灌胃造成急性酒精性肝损模型，测定各组的血清肝功能生化指标、TNF-α、核因子相关因子2（Nrf2）、CYP2E1活性及表达。试验结果表明，与对照组相比，GCB组可显著增强小鼠肝组织Nrf2表达并下调CYP2E1和TNF-α表达，且成剂量相关性，从代谢角度及生物分子层面解释GCB减轻乙醇导致急性肝氧化应激损伤机制。纪晓霞[87]在研究四君子汤对小鼠急性乙醇性肝损伤的干预作用中，对CYP2E1表达进行研究，发现四君子汤可以减少并抑制2E1的表达，从代谢机制方面解释其保肝作用。郑天慧等[88]通过用Cocktail法，研究扶正化瘀方对正常和肝纤维化大鼠CYP450同工酶的影响，发现扶正化瘀方对于正常大鼠CYP1A2，2C9，2C19，2D6具有明显的抑制作用，而对于肝纤维化模型大鼠则仅表现出对2C9的抑制作用，对包括3A4在内的其余4种同工酶则不再有明显的抑制/诱导作用。肝纤维化大鼠模型的选择更为贴近临床实际情况，扶正化瘀方作为抗纤维化用药，在不同病理形态下所产生的代谢作用是具有明显差异的，在临床应用过程中应当注意。

2.7 中医证候模型研究 杨志福等[89]应用Cocktail法评价急性血瘀症对大鼠CYP450酶活性的影响。以皮下注射盐酸肾上腺素注射液并寒冷刺激法造模急性血瘀症大鼠模型，模拟中医证候中的气滞血瘀和寒凝血瘀。与正常组相比，血瘀证组探针药物氨苯砜的半衰期（T_1/2）明显延长，清除率（CL）也减慢，咖啡因的T_1/2明显缩短，氯唑沙宗的T_1/2和CL则在2组中无显著性差异，说明血瘀证可以抑制CYP3A4，诱导1A2活性，对2E1无明显影响。Cocktail法为中医证本质的研究提供了新的思路和方法。

3 Cocktail法在中西医药领域应用特点差异

前文主要阐述Cocktail探针药物法在中医药领域内的应用进展，该法起源于西方，在西方医学中该法现主要应用于以下领域：①药物代谢途径确证及CYP酶活性影响考察；②新药开发临床前研究，针对CYP450酶代谢途径药物-药物相互作用筛选工具[3]；③评价肝脏代谢机能临床意义及疾病发病机制研究[90-92]；④CYP450酶表型分析，个体化差异研究[93]；⑤辅助肾功能评价研究[94]。Cocktail法的合理应用可以快速表征CYP450酶活性特点，为临床安全用药提供指导。

Cocktail探针药物法在中西医药领域应用的异同点比较见表6。

4 小结与展望

Cocktail探针药物法自其开发以来就以快速、准确、高通量的评价CYP450酶系活性而在医药研究领域受到重视，特别是在揭示药物相互作用和临床给药方案优化方面具有显著优势，除FDA外，我国CFDA在2012年5月发布的《药物相互作用研究指导原则》中也特别强调了研究CYP450酶的重要性。

中藥成分复杂，中药安全性研究极受重视，但在研究过程中明确药效物质基础和作用靶点、揭示药物体内代谢过程存在巨大的困难，Cocktail法的引入与使用为中药研究提供了新的思路，不但可以推断中药体内代谢过程，更为其炮制方法选择、组方配伍优化给出有效帮助从而达到减毒增效的目的，如运用得当则可以前瞻性的提高中药临床用药安全。

Cocktail法体外试验已被广泛应用于新药筛选及药物相互作用研究，但是其作为临床试验至今也还存在一定的争议，包括伦理方面的问题，同时给予多种探针药物后药物受试者的顺应性，所选定的探针药物是否合理，是否同时存在其他转运体或Ⅱ相代谢酶参与反应从而影响药物机体代谢过程等，说明Cocktail探针药物法还存在许多挑战及研究空间，但有理由相信伴随其方法的不断完善，必将发挥巨大的潜力和作用，为新药研发、中药大品种二次开发及指导临床合理用药提供更为详实的科学依据。

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[责任编辑 马超一]