慢性应激后小鼠空间学习记忆功能及脑内BDNF表达的变化

吴晨　赵晓东　宦冉　孙丽娟　单洁　李亚

【摘 要】目的：研究慢性应激后小鼠海马和前脑皮层BDNF表达的变化，探讨小鼠学习记忆功能变化的机制。方法：建立多因素慢性应激小鼠模型，通过Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力；免疫组织化学方法检测小鼠海马和前脑皮层BDNF表达水平的时序变化。结果：与对照组小鼠比较，慢性应激后即刻和24h组小鼠在水迷宫中的空间学习记忆能力明显减退（P<0.05， P<0.01），海马CA1、CA3、DG和前脑皮层BDNF的表达明显减少（P<0.05，P<0.01）；而慢性应激后一周组小鼠的学习记忆能力有部分恢复，海马各区和前脑皮层BDNF的表达亦有所增加，无显著性差异。结论：BDNF在海马和前脑皮层表达的下调，可能与慢性应激后小鼠学习记忆功能的损伤有关。

【关键词】慢性应激；学习记忆；BDNF；海马；前脑皮层

【Abstract】Objective：To explore the mechanism of learning-memory function alteration in mice after chronic stress， and the expressions of brain derived neurotrophic factor（BDNF） of prefrontal cortex （PFC） and hippocampus （HP） in mice.Methods：The chronic stress mice model was established by using multiple chronic unpredictable stressors.The abilities of learning-memory were measured using Morris water maze task.The expression of BDNF in PFC and HP were tested by immunohistochemical method.Result：The spatial learning-memory function in mice were significantly decreased （P<0.05， P<0.01） in immediately and 24h after stress groups， compared with control group mice.Meanwhile，the expression of BDNF in the CA1，CA3，DG of HP and PFC were significantly reduced （P<0.05，P<0.01）.A week after stress， the spatial learning-memory function in mice was partly enhanced，the expression of BDNF in HP and PFC were partly increased，and there was no significant difference.Conclusion：The impairment of learning-memory function induced by chronic stress in mice，which may be nearly associated with the down-regulated expression of BDNF.

【Key words】Chronic stress；Learning and memory；BDNF；Hippocampus；Prefrontal cortex

研究证实，长期的慢性应激状态，可引起机体内稳态失衡，脑内出现产生广泛的神经化学及形态学改变，动物的行为和学习记忆功能明显减退[1]。已有许多研究报道，海马和前额叶皮层是学习记忆信息储存和整合的关键脑区，并且在机体应激反应的调控中也具有重要作用。研究发现，慢性应激可引起海马神经元形态结构发生变化和丢失、亦可引起前额叶皮层体积变小、树突萎缩及神经元丢失等变化[2]，进而影响海马和前额叶皮层的功能。脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）属于神经营养因子家族的重要成员之一。研究报道，BDNF是中枢神经系统中分布最广、含量最高的神经营养因子，特别是海马、杏仁核、纹状体和皮层等部位都有丰富的表达，对神经细胞具有营养、支持和保护作用。BDNF可增强动物脑内神经细胞间的突触联系，从而使学习记忆功能增强[3]。本研究建立多因素慢性应激动物模型，检测慢性应激后小鼠学习记忆功能的变化，并且测定小鼠海马和前脑皮层神经元BDNF表达的动态变化，探讨BDNF在慢性应激所致小鼠学习记忆功能变化中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

昆明种3月龄健康小白鼠，SPF级，体重22±2g，雌雄各半，濟南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）20140007。实验小鼠在实验室适应一周。自由饮水进食。随机分为对照组和慢性应激组。

1.2 慢性应激动物模型制备

慢性应激组小鼠采用7种不同应激源，实验周期28天。为高台（高1.6m，直径0.05m，1h/次）、足底电击（电压36V，15秒/次，每次间隔1分钟，共30次）、通宵照明（10h）、冰水游泳（8oC冷水中游泳，3min）、禁食（36h）、禁水（24h）、斜笼拥挤（36h）。每天随机给予一种刺激；对照组小鼠在相同饲养环境中正常饲养，不接受任何实验应激源刺激。在慢性应激后即刻、应激后24h及一周进行水迷宫实验和BDNF检测。

1.3 Morris水迷宫检测学习记忆能力

采用Morris水迷宫进行两组小鼠的学习记忆能力检测。Morris 水迷宫为一圆形水池（直径80cm，高50cm），水温控制在25±1℃。水迷宫被均等分为四个象限，在第一象限（目标象限）水面下1cm放置一塑料平台，在其对面第三象限池壁中间位置放置一明显标记物。测试程序包括定位航行和空间搜索两部分。检测历时3天，其中前2天为定位航行，将小鼠分别从水迷宫的四个象限中心位置面向池壁轻轻放入水中，记录小鼠找到平台所需要的时间，即逃避潜伏期（Escape latency）。第3天为空间搜索试验，撤掉平台，将小鼠在第三象限池壁的中心点放入水中，记录小鼠在各个象限的游泳时间，总时间上限为120s。检测小鼠对平台（目标象限）的记忆能力。

1.4 小鼠海马和前脑皮层BDNF的表达

小鼠腹腔注射0.4%的戊巴比妥钠麻醉，暴露心脏，经心先灌注生理盐水，再以事先冰上预冷的多聚甲醛溶液（4%）灌注，完整取脑；置于固定液中后固定，梯度酒精脱水、透明和石蜡包埋，对脑组织进行连续冠状切片（片厚5μm）。采用SABC（链霉素过氧化复合物）免疫组织化学试剂盒，DAB显色剂进行免疫组化染色，BDNF多克隆抗体，购于武汉博士德生物工程有限公司。以PBS（磷酸盐缓冲液）代替一抗作阴性对照。采用Motic Images Advanced 3.2图像分析处理系统，分析计算海马CA1、CA3区、齿状回（DG）和前脑皮层（PFC）BDNF阳性神经元的数目。

1.5 统计学处理

数据均以平均数±标准差（M±s）来表示，逃避潜伏期采用重复测量方差分析（repeated-measures ANOVA）；各象限游泳时间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较以LSD法分析。其他数据组间比较用非配对t 检验分析。P<0.05 时说明有统计学差异。

2 结果

2.1 慢性应激后小鼠空间学习记忆功能的变化

统计学分析结果显示（表1），在定位航行中，两组小鼠随训练周期其逃避潜伏期均显著降低（对照组F=9.638，P<0.01；应激后即刻F= 6.366，P<0.01）。与对照组比较，应激后即刻、24h和应激后一周小鼠的逃避潜伏期均长于对照组小鼠（P<0.05，P<0.01）。

2.2 慢性应激后小鼠海马和前脑皮层BDNF的表达

小鼠免疫组化结果（表3），与对照组比较，在应激后即刻应激组小鼠PFC和海马CA1、CA3、DG区BDNF阳性神经元数目显著减少（P<0.05，P<0.01）；在应激后24h，仅在PFC和海马CA1、DG区BDNF阳性神经元数目明显减少（P<0.05）；而应激后一周则无显著性差异（P>0.05）。结果表明，慢性应激后小鼠海马和前脑皮层BDNF的表达减少，应激后一周有部分恢复。

3 讨论

本研究结果显示，慢性应激能够在一定程度上损伤小鼠的空间学习记忆。有研究报道，多因素的慢性应激可引起前额叶皮层和海马的选择性损伤，从而导致动物学习记忆障碍、痴呆、抑郁等[1]。已经明确，海马和前额叶皮层功能最复杂的脑区之一，在空间学习记忆、情绪、工作记忆以及行为计划和组织等方面具有重要作用，同时也是参与应激反应的重要脑区。慢性应激后，可引起海马神经元突触可塑性发生改变，空间学习记忆损伤[4]。研究报道，在不同应激刺激状态下，可引起动物的工作记忆功能明显受损[5]。BDNF是神经营养因子家族的重要成员。有研究报道，BDNF能维持成熟神经细胞的生存、生长、分化和凋亡，促进神经细胞的修复和再生[6]，增加神经细胞间的突触联系，能有效防止神经元的变性及死亡[7]。研究表明，BDNF广泛参与动物的学习记忆等认知功能，在神经元可塑性的调控中具有重要作用[3]。研究报道，BDNF mRNA高表达区在海马、上丘和内侧前额叶皮层，并且在海马内其表达量最丰富[8]。本实验室早先的研究显示，慢性应激后，小鼠出现抑郁样行为以及空间学习记忆能力显著降低，并且海马各区及前脑皮层BDNF表达降低[9]。在本研究中，慢性应激引起小鼠水迷宫空间学习记忆能力明显减退，脑内海马各区和前脑皮层BDNF的表达显著降低，但慢性应激后各项指标有部分恢复。结果提示，海马及前脑皮层神经元BDNF表达的下调，可能参与了慢性应激后小鼠空间学习记忆功能的损伤机制。

【参考文献】

[1]Lupien SJ，McEwen BS，Gunnar MR， et al.Effects of stress throughout the lifespan on the brain，behaviour and cognition[J].Nat Rev Neurosci，2009，10（6）： 434-445.

[2]Cerqueira JJ，Pego JM，Taipa R，et al.Morphological correlates of corticosteroid-induced changes in prefrontal cortex-dependent behaviors[J].J Neurosci，2005，25 （34）：7792-7800.

[3]Bekinschtein P，Cammarota M，Izquierdo I，et al.Reviews：BDNF and memory formation and storage[J].Neuroscientist，2008，14（2）：147-156.

[4]Hill M N，Hunter R G，McEwen B S.Chronic stress differentially regulates cannabinoid CB1 receptor binding in distinct hippocampal subfields[J].Europ J Pharmacol，2009，614（1-3）：66-69.

[5]Arnsten AF.Stress signalling pathways that impair prefrontal cortex structure and function[J].Nat Rev Neurosci，2009，10（6）：410-422.

[6]Greenberg ME，Xu BJ，Lu B，et al.New insights in the biology of BDNF synthesis and release：Implications in CNS function[J].J Neurosci，2009，29（41）：12764-12767.

[7]Roceri M，Cirulli F，Pessina C，et al.Postnatal repeated maternal deprivation produces age-dependent changes of brain-derived neurotrophic factor expression in selected rat brain regions[J].Biol Psychiatry，2004，55：708-714.

[8]Peters J，Dieppa-Perea LM，Melendez LM，et al.Induction of fear extinction with hippocampal- infralimbic BDNF[J].Science，2010，328（5983）：1288-1290.

[9]徐蕓，孔宏，宋倩，等.慢性应激对小鼠空间学习记忆功能及海马和前额叶皮层BDNF表达的影响[J].曲阜师范大学学报，2009，35：85-89.

[责任编辑：田吉捷]