家蚕的过敏原组分鉴定

毛露甜，袁于毅，丛淑洁

惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007

家蚕的过敏原组分鉴定

毛露甜，袁于毅，丛淑洁

惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007

目的：分析引起蚕过敏的组分。方法：利用磷酸缓冲液提取蚕茧和蚕蛹的总蛋白，用SDS-PAGE分析蚕蛋白组分，将蛋白胶转印到PVDF膜上，用蚕过敏患者的阳性血清进行IgE结合试验来鉴定蚕茧和蚕蛹的过敏原组分。结果：蚕茧蛋白可辨条带有8条，其相对分子质量分别约为18×103、27×103、30×103、38×103、42×103、44×103、51×103和58× 103；蚕蛹蛋白主带有6条，其相对分子质量分别约为23×103、27×103、30×103、33×103、38×103和51×103；蚕茧和蚕蛹在相对分子质量约30×103和51×103附近有2条印迹主带。结论：提示家蚕蛋白中存在特定的过敏原。该研究为蚕过敏的诊断和治疗提供了一定的实验基础。

家蚕；过敏原；SDS-PAGE；免疫印迹

过敏性疾病在过去的20多年里发病率逐年增加，包括接触性过敏、食入性过敏和吸入性过敏等类型[1]。家蚕（Bombyx mori Linaeus）属鳞翅目蚕蛾科，是完全变态的昆虫。家蚕是我国重要的经济昆虫，蚕丝和蚕茧、幼蚕、蚕蛹之间存在交叉反应性，蚕过敏者可对其中任一成分过敏。迄今，国内外对蚕丝过敏的报道较多，对蚕蛹过敏的报道较少，尚未见蚕尿、蚕蛾的鳞屑等过敏原的报道，只有部分实验室用它们的粗提液对病人进行皮试，证实其能引起过敏反应。其实蚕虫、蚕茧、蚕丝及其制品均可能导致过敏症，甚至蚕虫在生活周期产生的物质（如蚕尿、蚕蛹、蚕蛾鳞屑等）亦可诱发过敏反应[2]。故对于蚕及其分泌物引起的过敏性疾病应引起高度重视。

蚕丝由丝素（fibroin）和丝胶（sericin）组成，其中丝胶是水溶性的球蛋白，是蚕丝的主要变应原成分，引起由IgE介导的过敏反应。由于丝绸的制作工艺要经过反复洗涤和漂染，丝胶蛋白被破坏，故一般不引起过敏反应。而丝棉用作填充物或与棉线一起制作衣物，一般洗涤不彻底，大量丝胶仍存在于丝纤维表面，故在缫丝厂对蚕丝过敏者甚多见[3]。由于蚕蛹营养价值高，养蚕区有食用蚕蛹的习惯，由此引起的过敏症在我国有病例报道，而对蚕蛹变应原的基础研究报道较少。我们以蚕茧和蚕蛹为材料，用浸提法提取蚕蛋白，用SDS-PAGE和免疫印迹法分析它们的过敏原组分，以期为变态反应性疾病的特异性诊断和治疗提供重要依据。

1 材料和方法

1.1 材料

蚕茧及蚕蛹采自广东湛江市养蚕户，是未经任何加热处理的种茧和蛹，冷冻干燥保存。

惠州市中心人民医院检验科收集2例蚕过敏患者（K22）的阳性血清（蚕丝特异性sIgE检测结果为Ⅱ级），非蚕丝过敏健康者血清4份（血清中蚕丝sIgE检测结果为阴性）。分离血清并分装后于-80℃冻存备用。

HRP标记的羊抗人IgE购自Serotech公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma公司；蛋白质相对分子质量（Mr）标准购自TaKaRa公司；PVDF膜购自Osmonics公司；Mini Protean 11垂直板电泳仪和转移系统购自Bio-Rad公司；TG-20B高速冷冻离心机购自海安亭科学仪器厂；721分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司；TY-80B型脱色摇床购自江苏金坛市寰宇科学仪器厂。

1.2 蚕过敏原浸液的制备及Bradford法测定蛋白浓度

参照文献[4]方法略做修改。取蚕茧和蚕蛹，用剪刀剪碎后用预冷的丙酮覆盖至脱脂完全为止，置于通风橱中待丙酮完全挥发，以0.01 mol/L的PBS为提取液，按1∶20加入蚕茧或蚕蛹粉，置4℃冰箱冷浸过夜以提取过敏原蛋白；12 000 r/ min冷冻离心20 min，用考马斯亮蓝法进行蛋白定量后，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

1.3 SDS-PAGE法分析蚕粗提液的蛋白组分

配制15%分离胶和5%浓缩胶，将待分析的蚕粗提液与上样缓冲液等体积混合，煮沸3～5 min使蛋白变性，取20 μL样品上样，以溴酚蓝指示，考马斯亮蓝R-250染色后脱色至背景无色为止。

1.4 Western印迹分析蚕的过敏原组分

参照文献[5]方法，蚕茧和蚕蛹蛋白经SDSPAGE分离后，按150 mA/板约1 h的电转条件湿印迹至PVDF膜，TBS洗膜（5 min×3次），用30 g/L的BSA于4℃封闭过夜，与蚕过敏患者的阳性血清（1∶50）于37℃孵育4 h，同上洗涤后加入羊抗人IgE-HRP（1∶500）酶标二抗，37℃孵育2 h，用DAB显色，显色条带与蛋白标准对照，确定其相对分子质量。以正常人血清为阴性对照，鉴定蚕过敏的蛋白组分。

2 结果

2.1 蚕粗提液的蛋白浓度测定

BSA标准曲线见图1。用分光光度计测得蚕蛋白粗提液的D595nm值为0.371，根据BSA标准曲线，换算出蚕蛋白粗提液的浓度为0.828 mg/ mL。

图1 BSA定量标准曲线

2.2 SDS-PAGE分析蚕粗提液的蛋白组分

蚕粗提液的SDS-PAGE结果见图2，蛋白条带清晰，蚕茧和蚕蛹的蛋白Mr分布为14×103～97× 103。其中蚕茧可辨条带有8条，其Mr为18×103、27×103、30×103、38×103、42×103、44×103、51×103和58×103；蚕蛹蛋白主带有6条，其Mr为23×103、27× 103、30×103、33×103、38×103和51×103。

2.3 Western印迹分析蚕的过敏原

蚕蛋白经SDS-PAGE分离后用蚕丝过敏患者阳性血清及健康人阴性血清进行免疫印迹，结果见图3。蚕茧、蚕蛹与2份阳性患者血清均出现印迹条带，其中蚕茧蛋白与①号患者在Mr为18× 103、30×103、42×103、44×103和51×103附近有印迹带，主带为30×103和51×103，与②号患者仅在Mr为51×103附近有印迹带；蚕蛹蛋白与①号患者在Mr为30×103、44×103和51×103附近有印迹带，与②号患者在Mr为30×103和51×103附近有印迹带，主带均为30×103。而蚕茧、蚕蛹蛋白与混合阴性对照血清反应均没有出现印迹条带。

图2 家蚕蛋白粗提液的SDS-PAGE

图3 免疫印迹分析蚕茧和蚕蛹的过敏原

3 讨论

目前国内外对蚕过敏的研究主要围绕蚕丝过敏开展，对蚕蛹及蚕分泌物的过敏研究较少。深圳大学过敏反应与免疫学研究所曾对蚕蛹变应原做过相关研究，分离到蚕蛹Mr为27×103～ 138×103的17种蛋白质组分，并采用Western印迹鉴定到Mr分别为30×103、79×103及82×103的蚕蛹变应原，其中30×103是蚕蛹的主要变应原[6]。该团队还对义蚕、Ⅰ～Ⅴ龄蚕进行过敏原分析，发现Mr为79×103和82×103的蛋白是蚕的特异性变应原，而Ⅴ龄蚕比其他各龄蚕多出30×103的致敏条带，提示随着生长阶段的不同，蚕的致敏成分会发生一定的改变[7]。虽然研究方法类似，但本研究与其结果不尽一致，这可能与家蚕品系、蚕过敏患者的个体差异及实验方法等有关。本研究选用未经任何加工的废蚕茧代表导致接触性过敏的蚕丝，蚕蛹代表蚕食入性过敏材料，但因蚕这种完全变态的昆虫在整个生活周期所产生的分泌物都可能存在交叉反应，故本研究选取蚕茧和蚕蛹做材料并不能完全如实地反映蚕过敏。

本研究采用的显色条件直接影响实验结果，甚至在PVDF膜上的印迹条带会随着膜的干湿程度不同而有较大差别，这给拍照保留结果带来干扰。另外在确定蛋白质的相对分子质量上用的蛋白质标准品不同，或电泳条件不同都会影响后续结果。本研究尽可能地兼顾不同方面的要求以减少实验误差。

由于临床上蚕过敏患者较少，血清样本收集有一定难度。本研究只收集到2例蚕过敏患者血清，分别用蚕茧和蚕蛹蛋白与血清反复试验，结果重复性好。用健康人血清做阴性对照试验，Western印迹结果初步揭示了家蚕过敏原的Mr为30×103和51×103。这与Wen等[8]报道的蚕丝提取物Mr为21×103～95×103范围有蛋白条带，蚕丝过敏者血清集中与Mr为35.1×103～50×103的单一蛋白带结合这一结果较接近。北京协和医院变态反应科实验室用免疫印迹法证实血清IgE-Sw识别的蛋白带主要是Mr为35.1×103～50×103和21.9×103以下[9]。本研究鉴定的家蚕主要变应原是Mr为30× 103和51×103的组分，其中30×103组分与上述多方研究较一致，可为吸入性过敏症的脱敏治疗及哮喘病的预防提供试验依据。

高纯度的蚕类过敏原标准品有利于蚕过敏性疾病的诊断及治疗。目前临床上使用的蚕过敏原的粗浸液因取材和提取方法的不同其有效成分存在较大的批间差异，用其进行皮试诊断亦存在一定的风险。考虑到缫丝时的高温会破坏丝胶蛋白，故本实验浸提蚕过敏原的材料选择了未经任何加热处理的种茧。目前家蚕基因组学及蛋白质组学研究已开展，确定蚕过敏基因并进行蛋白表达，用纯化的过敏原蛋白标准品替代蚕粗提液，有望提高诊断的特异性，减少治疗的副作用。

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Identification of the Allergens of Silkworms

MAO Lu-Tian*,YUAN Yu-Yi,CONG Shu-Jie
Department of Life Science,College of Huizhou,Huizhou 516007,China

Objective:To identify the allergen composition in silkworms.Methods:The total proteins of silk⁃worm cocoon and silkworm chrysalis were extracted with PBS,and they were analyzed by SDS-PAGE,and West⁃ern blotting to find the allergen composition.Results:The Mrof main protein in silkworm cocoon were about 18× 103,27×103,30×103,38×103,42×103,44×103and 51×103.and Mrof main protein in silkworm chrysalis were about 23×103,27×103,30×103,33×103,38×103and 51×103.The main detected allergic protein in silkworm cocoon and silkworm chrysalis were about 30×103and 51×103.Conclusion:There were common allergens in silkworm co⁃coon and silkworm chrysalis.The study can provide experiment basis for desensitization treatment of inhalant aller⁃gy and asthma prevention.

silkworms;allergen;SDS-PAGE;Western blotting

R392.1

A

1009-0002（2017）02-0141-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.015

2016-10-13

惠州市科技计划（2006P45）；惠州学院校立项目（C206·0209）

毛露甜（1972-），女，副教授，硕士

毛露甜，（E-mail）mlt@hzu.edu.cn

*Corresponding anthor,E-mail:mlt@hzu.edu.cn