基于高效液相色谱法的牛黄解毒制剂中胆红素含量测定

罗亚玲， 周 娟， 齐景梁

(四川省食品药品检验检测院， 四川 成都 610097)

基于高效液相色谱法的牛黄解毒制剂中胆红素含量测定

罗亚玲， 周 娟， 齐景梁

(四川省食品药品检验检测院， 四川 成都 610097)

利用高效液相色谱法建立牛黄解毒制剂中胆红素的含量测定方法，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，流动相为乙腈—1%冰醋酸(95∶5)，检测波长为450 nm.结果显示，胆红素进样量在0.8321～208.032 ng范围内具有良好的线性关系，r=0.9995，牛黄解毒片平均回收率为105.6%，RSD为1.42%，牛黄解毒丸平均回收率为96.2%，RSD为1.83%.结果表明，方法准确、简便，可作为牛黄解毒片及牛黄解毒丸等制剂中胆红素含量的测定方法.

牛黄解毒制剂；胆红素；液相色谱法

0 引 言

牛黄解毒片和牛黄解毒丸的处方主要由人工牛黄、雄黄和黄芩等8味药材组成[1]，具有清热解毒之功效，临床上常用于火热内盛、咽喉肿痛、牙龈肿痛、口舌生疮及目赤肿痛等症.人工牛黄为方中主药，系我国药学工作者根据天然牛黄的成分研制而成，具体由胆红素、胆酸、胆固醇等配制而成.胆红素是人工牛黄中的主要成分，有解热、降压、抗病毒等作用，也是评价人工牛黄品质优劣的依据[2-5]，故考察牛黄解毒制剂中胆红素的含量具有现实意义.

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用材料包括：胆红素对照品(批号，100077-200805，含量测定用，含量以98.5%计，使用前无需干燥处理)，由中国生物制品检定所提供；牛黄解毒片(批号，B82015)，由天津同仁堂集团股份有限公司生产；牛黄解毒丸(水蜜丸)(批号，1120668)，由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯.

1.2 仪 器

实验所用主要仪器为Waters 2695-2489-2998型液相色谱仪(美国沃特世公司).

2 方法与结果

2.1 色谱条件

实验色谱条件为：色谱柱，Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈—1%冰醋酸溶液(95∶5)；柱温35 ℃；流速0.7 mL·min-1；检测波长450 nm.

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备.

取胆红素对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1 mL含4.16 μg的溶液，制得对照品溶液.

2.2.2 供试品溶液的制备.

精密称取牛黄解毒片细粉适量(相当于大片4片或小片6片(糖衣片除糖衣，或水蜜丸细粉2 g))，置50 mL棕色量瓶中，精密加入二氯甲烷—甲醇(1∶1)混合溶剂25 mL(水蜜丸加10 mL)，称重，冰水浴超声20 min，取出，补重，滤过，取续滤液，制得供试品溶液.

2.3 测定法

分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定.

2.4 专属性考察

分别取阴性样品(缺胆红素)供试溶液、胆红素对照品溶液、牛黄解毒片供试品溶液，按上述色谱条件进行实验.结果显示，阴性样品对胆红素的测定无干扰，结果如图1、2所示.

A.胆红素对照品、牛黄解毒片样品；B.和阴性样品；C.色谱图

A.胆红素对照品；B.牛黄解毒丸样品和阴性样品；C.色谱图

2.5 线性范围考察

精密称取胆红素对照品(含量98.5%)10.56 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为S1；精密吸取S1 1mL，加三氯甲烷稀释至25 mL量瓶中，摇匀，作为S2；精密吸取S2 1 mL，加三氯甲烷稀释至10 mL量瓶中，摇匀，作为S3.分别精密吸取S3 2 μL、5 μL、10 μL及S2 5 μL、10 μL及S1 2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积，并以峰面积(A)为纵座标，胆红素进样量(ng)为横座标，进行回归，得回归方程，

A=8 158.06C-11 324.30，r=0.9995

结果表明，胆红素在进样量为0.8321～208.032 ng时，与峰面积线性关系良好.

2.6 精密度

精密量取胆红素对照品溶液(浓度10.9532 μg·mL-1)5 μL，连续进样6次，其RSD为0.52%.表明仪器的精密度良好.

2.7 重复性

取牛黄解毒片细粉适量(相当于大片4片或小片6片(糖衣片除糖衣，或水蜜丸细粉2 g))，精密称定，各6份，照“2.2.2”项下方法制备溶液并测定含量，测得牛黄解毒片胆红素平均含量为67.24 μg·g-1(RSD=0.91%)，牛黄解毒丸胆红素平均含量为32.24 μg·g-1(RSD=1.73%).结果表明，方法的重复性良好.

2.8 加样回收率

分别取已知含量的牛黄解毒片细粉(含量为67.24 μg·g-1)1.0 g，牛黄解毒丸细粉(含量为32.24 μg/g)1.0 g，各6份，精密称定，置于50 mL棕色量瓶中，精密加入胆红素对照品溶液(C=3.5051 μg·mL-1)25 mL(片剂)或10 mL(丸剂)，称定质量，按照拟定方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图，计算回收率，结果见表1、表2.

表1 牛黄解毒片中胆红素的加样回收实验结果(n=6)

表2 牛黄解毒丸中胆红素的加样回收实验结果(n=6)

2.9 检测限考察

精密量取胆红素对照品溶液(C=0.09266 μg·mL-1)5 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，结果显示，S/N≈3.确定本品检测限为0.46 ng，折算成样品中的检测限即为:牛黄解毒片0.4 μg·片-1或大片0.6 μg·片-1，牛黄解毒丸1.15 μg·g-1(水蜜丸/水丸)或大蜜丸0.46 μg·g-1.

2.10 样品测定

依据建立的胆红素含量测定方法，对2批次牛黄解毒丸(水蜜丸)和246批次的牛黄解毒片进行了考察.2批次水蜜丸中，胆红毒含量分别为46.91 μg·g-1和48.42 μg·g-1；246批次牛黄解毒片剂样品中，胆红素含量从0.00 μg·片-1～50.82 μg·片-1(220批次小片)，9.80 μg·片-1～55.602 μg·片-1(26批次大片)，含量差异很大.结果见图3、图4.

图3 牛黄解毒片(小片)胆红素含量结果

3 讨 论

由于胆红素不溶于水，可溶于苯、三氯甲烷及二硫化碳等有机溶剂中，但这些溶剂毒性均较大.对此，本研究考察了毒性较低的二氯甲烷、二氯甲烷—甲醇(8∶2)、二氯甲烷—甲醇(1∶1)3种提取溶剂，并同三氯甲烷作了比较.结果表明，二氯甲烷同三氯甲烷提取效果一致，二氯甲烷—甲醇(8∶2)同二氯甲烷—甲醇(1∶1)提取效果一致，且所提取的胆红素含量高于二氯甲烷与三氯甲烷，原因可能是加了甲醇后，溶剂对样品的渗透性较好，因而提取率更高.考虑到二氯甲烷的挥发性较强，最终选择了甲醇比例更高的溶剂，即二氯甲烷—甲醇(1∶1)为提取溶剂.

胆红素对光和热不稳定，因此本实验全程避光，并采用冰浴超声的方法进行提取.在制备工艺中，人工牛黄一般在压片或制丸之前加入，根据牛黄解毒片处方分析，胆红素理论含量分别为32 μg·片-1(大片)、21 μg·片-1(小片)、27 μg·g-1(水蜜丸).测定结果显示，246批样品胆红素含量相互之间差异较大，原因可能是由于原标准中无胆红素的含量测定项目，缺乏对厂家投料的监控.因此，本品标准的完善具有紧迫性和重要性.

本研究采用高效液相色谱法测定牛黄解毒片/水蜜丸中胆红素的含量，结果准确，重复性好，获得了理想的检测效果，可以作为牛黄解毒制剂的人工牛黄的质量评价鉴定方法，为其质量控制提供依据.本研究建议在牛黄解毒剂原标准中增加胆红素的含量测定，具体为：牛黄解素片中胆红素大片含量不得少于30 μg·片-1，小片胆红素含量不得少于20 μg·片-1；牛黄解毒丸(水蜜丸)中含胆红素含量不得少于25 μg·片-1.

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]吴红霞，付锦江.高效液相色谱法测定西黄片中人工牛黄的胆红素含量测定[J].当代医学，2009，15(4)：124-125.

[3]杨云沛，黄志东，李海生.人工牛黄及天然牛黄中胆红素的HPLC测定方法研究[J].天津药学,1995，7(2)：15-16.

[4]罗珍妹，陈晓玲.高效液相色谱法测定人工牛黄中胆红素的含量[J].海峡药学,2010,22(6)：48-50.

[5]王宜祥，傅剑飞.HPLC法测定小儿速效感冒灵中胆红素含量[J].现代应用药学，1996，13(6)：59-61.

Determination of Bilirubin Content in Bezoar Detoxication Preparation by HPLC

LUOYaling，ZHOUJuan，QIJingliang

(Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610097, China)

The paper is going to establish a method for the determination of bilirubin in bezoar detoxicatio preparation.Liquid chromatography is used.The chromatography column is C18column;mobile phase is acetonitrile-1% acetic acid(95∶5);the detection wavelength is 450 nm.The results show that the amount of bilirubin in the sample has a high linearity among the range of 0.8321～208.032 ng,r=0.9995;the average recovery rate of the bezoar detoxicatio tablets is 105.6%,RSD=1.42%;the average recovery rate of bezoar detoxicatio pills is 96.2%,RSD=1.83%.The results demonstrate that this method is accurate and simple,and can be used as the method to determine the bilirubin content in bezoar detoxicatio tablets and pills.

bezoar detoxication preparation;bilirubin;liquid chromatography

1004-5422(2017)01-0021-04

1004-5422(2017)01-0018-03

2016-11-21.

罗亚玲(1978 — )， 女， 中药师， 从事中成药制剂有效成分检测与分析.

R927.2；O657.7+2

A