一测多评法测定丹参酚酸类提取物中4个成分含量

刘 涛, 赵 群, 杨 丹， 郑秋艳, 张 倩， 邓燕君

(1.成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106; 2.成都大学 张澜学院， 四川 成都 610106)

一测多评法测定丹参酚酸类提取物中4个成分含量

刘 涛1, 赵 群1, 杨 丹1， 郑秋艳2, 张 倩1， 邓燕君1

(1.成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106; 2.成都大学 张澜学院， 四川 成都 610106)

建立同时测定丹参总酚酸提取物中丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的一测多评法，并进行方法学考察.以丹酚酸B为内参物，建立丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸相对于丹酚酸B的相对校正因子.通过相对校正因子计算其他3个成分的含量，并将计算结果与外标法实测结果用相对偏差进行比较.结果表明，各相对校正因子重现性良好，一测多评法的计算值与外标法实测值无显著差异.方法具有简便准确等优点，可用于控制丹参总酚酸提取物的内在质量.

丹参总酚酸提取物；一测多评；相对校正因子；外标法

0 引 言

丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，是临床常用中药，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦等功效.药理研究表明，丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B等丹参酚酸类成分具有改善微循环、抑制血小板聚集、抗氧化等作用，是丹参活血化瘀的主要成分.在2015年版的《中国药典》丹参总酚酸提取物质量标准中，仅以迷迭香酸和丹酚酸B为检测指标，而按照传统中医药学的“整体观”，采用现行的利用1～2种化学成分评价中药质量的模式，不能表征中药化学成分的整体性和复杂性，因此，多成分同步质量控制模式应运而生.目前，采用常规方法以多个成分含量测定来评价丹参水溶性提取物的研究已有报道，但这些方法存在着对照品消耗大，而且操作复杂、检测成本昂贵等缺陷.对此，一些学者提出了一测多评法，即只采用1个对照品来实现对多个成分的同步测定[2-5]，此法已被2015年版《中国药典》一部收载，并在丹参、人参、黄连等药材中得到验证.在此基础上，本研究采用一测多评法，建立了以丹酚酸B为对照，同步测定丹参总酚酸提取物中酚酸类成分的分析方法，并验证了此方法的适用性和可行性，拟实现丹参酚酸类成分多指标质量评价.

1 试药与仪器

1.1 试 药

实验所用试药包括：丹参素钠对照品(批号，141018)购于四川省维克奇生物科技有限公司，供含量测定用，纯度大于98%；原儿茶醛对照品(批号，150319)、迷迭香酸对照品(批号，140311)、丹酚酸B对照品(批号，151118)均购于成都植标化生物技术有限公司，供含量测定用，纯度均大于98%；丹参总酚酸提取物由实验室自制；甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：依利特P230Ⅱ型高效液相色谱系统(P230Ⅱ高压恒流泵、UV230Ⅱ紫外—可见检测器、AS1201自动进样器)、依利特Ichrom高效液相色谱系统(大连依利特公司)，FA2004型分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)，KQ-100E型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司).

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 色谱条件.

实验的色谱条件为：Hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1 %磷酸水溶液(B)，梯度洗脱0～15 min,10%～15% A；15～25 min,15%～25% A；25～35 min,25%～30% A；35～40 min,30%～90% A；40～50 min,90% A；流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长282 nm，进样量10 μL.在该色谱条件下，各待测成分分离度良好，其色谱图如见图1所示.

1.丹参素钠；2.原儿茶醛；3.迷迭香酸；4.丹酚酸B

2.1.2 混合对照品溶液的制备.

取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度分别为0.3196 mg/mL、0.0344 mg/mL、0.0632 mg/mL及0.6872 mg/mL的混合对照品溶液0#，备用.分别精密吸取上述混合对照品溶液0.5、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL置5 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液1#～6#.

2.1.3 供试品溶液的制备.

取丹参总酚酸提取物1.0 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，精密吸取1 mL上述稀释液置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液.

2.1.4 线性关系考察.

分别精密吸取“2.1.2”项下6个浓度的混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪.以测得的峰面积和进样量进行线性回归，得到各成分的回归方程以及线性范围(见表1).结果表明，丹参酚酸混合对照品溶液在此范围内线性关系良好.

2.1.5 精密度.

精密吸取2#混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录丹参素钠、 原儿茶醛、 迷迭香酸、 丹酚酸B4种酚酸类成分的峰面积，计算RSD.结果显示，各成分峰面积的RSD分别为1.04%、0.92%、1.26%、1.24%，表明仪器的精密度良好.

表1 丹参酚酸的线性范围(n=2)

2.1.6 稳定性.

取同一批丹参总酚酸提取物供试品溶液，分别于样品制备后的第0、2、4、6、8、12 h，精密吸取10 μL进样，测定峰面积，计算RSD.结果显示，丹参总酚酸提取物中丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 4种酚酸类成分峰面积的RSD分别为1.74%、0.96%、2.67%、1.51%，表明在12 h内，供试品溶液的稳定性良好.

2.1.7 重复性.

取同一批丹参总酚酸提取物1.0 g，精密称定，按供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，精密吸取10 μL进样，测定峰面积，计算提取物含量及RSD.结果显示，丹参总酚酸提取物中丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 4种酚酸类成分的含量分别为2.563%、0.501%、0.820%、11.708%，RSD分别为2.59%、2.68%、2.92%、3.10%，表明本方法的重复性良好.

2.1.8 加样回收.

取同一批已知含量的丹参总酚酸提取物0.5 g，精密称定，平行6份，分别按提取物含量—对照品(1∶1)的比例加入一定量的对照品溶液，按供试品溶液制备方法，测定并计算各成分的加样回收率以及RSD(见表2).结果显示，丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 4种酚酸类成分的加样回收率分别为99.1%、101.1%、99.0%、98.7%，RSD分别为3.02%、1.98%、2.80%、2.39%，表明本方法的准确度良好.

2.2 相对校正因子的确定

以丹酚酸B为内参物，根据相对校正因子计算公式，分别计算丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸与内参物丹酚酸B的相对校正因子，结果见表3.

2.3 一测多评法的耐用性和系统适应性评价

为使所建立的各待测成分的相对校正因子能用于常规检验，针对可能影响相对校正因子重现性的因素，本研究设计了一系列实验，并考察了不同实验条件对相对校正因子重现性的影响，同时对相对校正因子值影响大的因素进行具体分析后加以限定，以保证本方法有效.

表2 加样回收试验结果

表3 丹参酚酸的相对校正因子(n=2)

2.3.1 不同仪器对相对校正因子的影响.

实验在不同实验室进行，采用依利特Hypersil C18色谱柱，分别考察了依利特P230Ⅱ和依利特Ichrom 2种不同的高效液相色谱系统对丹酚酸相对校正因子的影响(见表4).结果显示，各成分相对校正因子重复性良好(RSD<5 %).

表4 不同仪器对相对校正因子的影响(n=2)

2.3.2 不同色谱柱对相对校正因子的影响.

实验在同一实验室进行，采用依利特P230Ⅱ和依利特Ichrom 2种不同的高效液相色谱系统，分别考察了Hypersil C18色谱柱2种不同批号的色谱柱对丹参酚酸相对校正因子的影响(见表5、表6).结果显示，各成分相对校正因子重现性良好(RSD<5 %).

表5 不同色谱柱对相对校正因子的影响——依利特P230Ⅱ(n=2)

表6 不同色谱柱对相对校正因子的影响——依利特Ichrom(n=2)

2.3.3 不同柱温对相对校正因子的影响.

实验在同一实验室进行，采用依利特P230Ⅱ高效液相色谱系统和Hypersil C18色谱柱分别考察了不同柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃)对丹参酚酸相对校正因子的影响(见表7).结果显示，各成分相对校正因子重现性良好(RSD<5%).

表7 不同柱温对相对校正因子的影响(n=2)

2.3.4 不同流速对相对校正因子的影响.

实验在同一实验室进行，采用依利特P230Ⅱ高效液相色谱系统和色谱柱Hypersil，分别考察了不同流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)对丹参酚酸相对校正因子的影响(见表8).结果显示，各成分相对校正因子重复性良好(RSD<5%).

表8 不同流速对相对校正因子的影响(n=2)

2.4 一测多评法待测色谱峰的定位

分别考察了相对保留值和保留时间差在不同仪器和不同批号色谱柱中的重现性.通过比较发现，保留时间差的波动相对较小(RSD<3 %),因此采用保留时间差进行丹参总酚酸提取物中酚酸类成分色谱峰的定位较为可行，可准确判断出目标峰的位置.实验结果见表9、10.

表9 QAMS法待测成分色谱峰的定位——相对保留值

表10 QAMS法待测成分色谱峰的定位——保留时间差

2.5 一测多评法与外标法测定结果的比较

精密吸取供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪测定：采用外标法对丹参总酚酸提取物中4种酚酸类成分进行多成分同步测定，利用所建立的一测多评法对其含量进行计算，并将两种方法计算的结果进行比较，以验证此法用于酚酸类多指标成分质量评价的可行性和准确性，实验结果见表11.结果显示，外标法实测值与一测多评计算的含量值没有显著差异，相对偏差<5 %.结果表明，本研究建立的方法可用于丹参酚酸多成分的质量评价研究.

3 讨 论

本研究采用HPLC在波长282 nm检测时，色谱峰分离度良好，达到基线分离，各待测成分色谱峰纯度符合要求，表明各色谱峰内无杂质干扰，因此确定282 nm作为检测波长.对于目标色谱峰的定位，本研究分别采用保留时间差(待测成分与内参物间保留时间的比值)和相对保留值(待测成分与内标物间保留时间的比值)作为定位标准，以丹酚酸B为内参物，并在2种不同高效液相色谱系统和2种不同色谱柱下对这2个参数进行考察.结果显示，采用各待测成分间的保留时间差更能够准确定位上述目标色谱峰.

丹参作为临床常用中药，一直是行业研究的重点，关于丹参药材的一测多评法已被2015年版《中国药典》所收载.目前，对于丹参水溶性提取物的一测多评法也已有报道，例如，王小平等[6]以丹参素钠为内参物，建立了丹参水溶性提取物中紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B相对于丹参素钠的相对校正因子，从而实现一测多评.本研究主要以丹酚酸B为内参物，建立丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸相对与丹酚酸B的相对校正因子，采用HPLC外标法测定了丹参总酚酸提取物中丹酚酸B，用相对校正因子计算得到丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸的含量，通过对10批丹参总酚酸提取物的含量测定发现，利用一测多评法计算的含量与外标法实测值所得含量没有明显差异.经方法学考察表明，本方法精密度、稳定性、重复性及准确度均良好.同时，对所建立的相对校正因子进行系统适应性考察，验证了本方法的准确性和适应性.因此，一测多评法可用于丹参总酚酸提取物中酚酸类成分的质量评价.

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2015:384-385.

[2]王智民，钱忠直，张启伟，等.一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志，2011，36(6)：657-658.

[3]王智民，高惠敏，付雪涛，等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志，2006，31(23)：1925-1928.

[4]杨菲，王智民，张启伟，等.“一测多评”法测定丹参酚酸类成分的含量[J].中国中药杂志，2011，36(17)：2372-2379.

[5]朱晶晶，王智民，匡艳辉，等.一测多评法同步测定人参和三七药材中多种人参皂苷的含量[J].药学学报，2008，43(12)：1211.

[6]王小平，龙凯花，李丹，等.一测多评HPLC法测定丹参水溶性提取物中4个水溶性成分含量[J].现代中医药，2014，34(1)：84-86.

[7]李倩，刘伟，罗祖良，等.一测多评法测定丹参中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮的含量[J].中国中药杂志，2012，37(6)：824-828.

[8]蓝天凤，王晓，王岱杰，等.一测多评法测定丹参中4种丹参酮类成分[J].中草药，2012，43(12)：2420-2423.

Determination of 4 Components' Content in Salvianolic Acid Extracts by QAMS

LIUTao1,ZHAOQun1,YANGDan1,ZHENGQiuyan2，ZHANGQian1,DengYanjun1

(1.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China; 2.School of Zhanglan, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The paper is going to establish a quantitative analysis of multi-components by single-marker(QAMS) for the determination of salvianolic acid extract of salvianic acid sodium,protocatechualdehyde,rosmarinic acid,and salvianolic acid B of total salvianolic acid extract at the same time.Besides that,the methodology is studied.The salvianolic acid B is used as the internal reference,and the relative correction factor of salvianic acid sodium,protocatechualdehyde,rosmarinic acid relative to salvianolic acid B is established.According to the relative correction factor,the content of other 3 components is calculated,and the calculation results are compared with the measured results by external standard method based on relative deviation.The results show that the relative correction factor is of good reproducibility,and the calculation value of QAMS method is similar to the measured value of external standard method.The conclusion indicates that the QAMS method is simple and accurate,and therefore can be used for quality control of total salvianolic acid extract.

total phenolic extract of Salvia miltiorrhiza;quantitative analysis of multi-components by single-marker(QAMS);relative correction factor;external standard method

1004-5422(2017)01-0007-05

2017-02-19.

四川省千人计划(2013332)资助项目.

刘 涛(1976 — )， 男， 博士， 高级工程师， 从事中成药新药开发与中药质量再评价研究.

R284.2

A