菊芋叶中多酚类成分的提取分离及结构鉴定

袁晓艳,封冬梅,陈晓兰

(遵义医学院 药学院 分析化学教研室,贵州 遵义 563099)

菊芋叶中多酚类成分的提取分离及结构鉴定

袁晓艳,封冬梅,陈晓兰

(遵义医学院 药学院 分析化学教研室,贵州 遵义 563099)

采用不同极性溶剂提取了菊芋叶中的多酚类成分，经正、反相色谱结合的方法分离纯化了这些成分，并根据UV、MS和NMR数据鉴定了它们的化学结构。从菊芋叶中分离并鉴定的7个多酚化合物分别为咖啡酸(1)、3,5-二咖啡酰奎尼酸(2)、1,5-二咖啡酰奎尼酸(3)、4,5-二咖啡酰奎尼酸(4)、3,5-二咖啡酰奎尼酸甲酯(5)、5,8-diOH-6,7,4'-triOMe(pedunculin) (6)、5,8-diOH-6,7diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone(7),其中化合物1～5为酚酸类化合物,化合物6～7为黄酮类化合物。仅通过1H-NMR即可确定4个二咖啡酰奎尼酸化合物中2个咖啡酰基的取代位置。

菊芋叶;酚酸;黄酮;分离;结构鉴定

菊芋(HelianthustuberosusL.)原产于北美洲,俗称洋姜、鬼子姜,为菊科(Compositae)向日葵属(HelianthusL.)多年生草本植物。传统上,菊芋被当作食物或者动物饲料。在过去的2个世纪里,人们发现菊芋块茎富含菊糖,是自然界已知含有菊糖的36000种植物中菊糖含量最高的植物之一,开始开发利用菊芋中的菊粉、低聚果糖和果糖等作为功能性食品的添加剂[1-2]。菊芋地上部分主要含有酚酸、黄酮及倍半萜内酯类化合物,具有抗氧化、杀虫抑菌、抑制肿瘤细胞生长等活性[3-9]，但对其研究开发较少。笔者曾利用高效液相色谱电喷雾电离质谱联用技术,初步鉴定出菊芋叶中7个绿原酸类化合物，并测定了菊芋叶中含量最大的成分绿原酸的含量[3,10]。本实验通过进一步分离纯化研究,从菊芋叶中分离得到7个多酚类化合物,并对其结构进行了鉴定。

1 仪器、试剂及材料

Bruker Avance-500核磁共振仪； Thermo Finnigan TSQ质谱仪,电喷雾离子源(ESI)； Waters DP-4000制备液相色谱, Waters Prep Nova-Pak C18径向加压柱(300 mm ×20 mm,6 μm)； Waters 2690高效液相色谱仪,配996型二极管阵列检测器。聚酰胺树脂(30～60目)，为浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂生产; H60型薄层层析硅胶(200～300目)，为青岛海洋化工厂生产;石油醚(分析纯,科密欧);乙酸乙酯(分析纯,科密欧);甲醇(色谱纯,山东禹王); Millipore超纯水。

实验所用菊芋叶于2010年11月采摘于陕西榆林地区,由南京农业大学资源与环境学院刘兆普教授鉴定为菊科向日葵属菊芋的干燥叶子。

2 提取和分离

2.1 酚酸类化合物的提取分离

将干燥菊芋叶1 kg粉碎后,以20倍量(v/m)60%乙醇回流提取2次；合并提取液，减压浓缩得浸膏248 g,浸膏得率为24.8%。取200 g浸膏用热水溶解,对悬浮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次后浓缩至浸膏状,分别得到石油醚萃取物6.4 g、乙酸乙酯萃取物53.0 g、正丁醇萃取物41.0 g,水部位重105.0 g。其中乙酸乙酯萃取部位过聚酰胺树脂，以乙醇-水梯度洗脱[10∶(90～100)∶0]，得6个部位P1～P6；经高效液相色谱分析后,合并P3、P4部位,以反相制备液相色谱在洗脱剂甲醇-0.5%乙酸水(36∶64)等度洗脱条件下得到化合物1(80.20 mg)、2(48.60 mg)、3(500.00 mg)、4(35.00 mg)、5(20.00 mg)。

2.2 黄酮类化合物的提取分离

称取菊芋叶6 kg,以乙酸乙酯浸泡提取,每次浸泡24 h,提取3次,过滤后合并提取液,减压浓缩至浸膏状,浸膏以甲醇溶解,过滤除去甲醇不溶物,得到菊芋总提取物浸膏170 g。将浸膏过200～300目硅胶柱层析,以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱[90∶(10～20)∶80],收集石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)、石油醚∶乙酸乙酯(8∶2)、石油醚∶乙酸乙酯(6∶4)、石油醚∶乙酸乙酯(4∶6)、石油醚∶乙酸乙酯(2∶8)洗脱液,分别命名为F1～ F5；F3部位过H60型薄层层析硅胶装填中压制备柱进行进一步分离,用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(90∶10、80∶20、70∶30、60∶40),最后以甲醇冲洗色谱柱,得P1～P6六个洗脱部位。P3部位得黄色针状晶体,过滤得化合物6(236.00 mg); P4部位放置后有淡黄色晶体沉淀,过滤,得化合物7(148.00 mg)。

3 结构鉴定

3.1 化合物1的结构鉴定

化合物1为淡黄色粉末,易溶于热水及甲醇, mp 208～210 ℃,UV(MeOH-H2O):239.4,323.2 nm。1H-NMR(DMSO-d6,500 MHz):7.42 (1H,d,J=5.8 Hz,H-7),7.03 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.96(1H, dd, J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.76(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.17(1H,d,J=15.8 Hz,H-8)。13C-NMR(DMSO-d6,125 MHz):168.4 (C-9),148.1(C-4),145.5(C-7),144.5(C-3),125.7(C-1),121.1(C-8),115.73(C-2),115.12(C-5),114.61(C-6)。以上数据与文献[11]基本一致,故确定化合物1为咖啡酸。

3.2 化合物6的结构鉴定

化合物6为黄色针状晶体,易溶于氯仿,三氯化铁显色阳性。ESI-MS:344(M+),329,314,299,依次失去3个甲基。1H-NMR(CDCl3, 300 MHz)δ:12.75(1H,s,C5-OH),7.89(2H,dd,J=2,6.8 Hz,H-2′,6′), 7.04(2H,dd,J=2.72 Hz, H-3′,4′),6.59(1H,s,H-3),3.901～4.021(3H each,s,OMe×3)。C-NMR(CDCl3,300 Hz)δ:183.2(C-4),164.0(C-2),162.9(C-4′),149.0(C-7),148.6(C-9),146.0(C-5),130.9(C-6),130.1(C-2′,C-6′),127.6(C-1′),115.7(C-3′,C-4′),104.8(C-10)103.9(C-3),62.03(-OCH3),61.2(-OCH3),55.8(-OCH3)。以上数据与文献[12]基本一致,鉴定化合物6为5,8-diOH-6,7,4′-triOMe(pedunculin)。

3.3 化合物7的结构鉴定

化合物7为黄色粉末(氯仿)，mp:190～192 ℃,ESI-MS:374(M+),359,344,329,314,依次失去4个甲基。1H-NMR(CDCl3,300 MHz)δ:7.60(1H,dd,J=2.1,8.4 Hz,H-6′),7.42(1H,d,J=1.8 Hz,H-5′),7.01(1H,d,J=8.7 Hz,H-2′),6.76(1H,s,H-3),3.98～4.05(3H each,s,OMe×4)。C-NMR(CDCl3,300 Hz) δ:182.3(C-4),162.9(C-2),152.1(C-3′),150.9(C-4′),149.0(C-9),148.3(C-7),145.4(C-6),131.5(C-5),127.9(C-8),122.9(C-1′),119.7(C-6′),111.7(C-5′),109.1(C-2′),103.3(C-10),102.9(C-3),61.1(-OCH3),60.1(-OCH3),55.7(-OCH3×2)。以上核磁数据与文献[13]报道数据基本一致,鉴定化合物7为5,8-diOH-6,7diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone。

3.4 化合物2～5的结构鉴定

化合物2～5在242 nm和327 nm附近有最大紫外吸收,一级质谱负离子全扫描结果表明化合物2～4的m/z均为514.9,化合物5的m/z为529。负离子模式下二级质谱扫描结果显示,化合物2～5均存在191、179、173、161四个特征离子碎片,应为[quinic acid-H]-、[caffeic acid-H]-、[quinic acid- H2O -H]-和[caffeic acid-H2O-H]-。由此可以确定化合物2～5为二咖啡酰奎尼酸类化合物。单从一级二级质谱难以确定咖啡酰基在奎尼酸上的取代位置,必须辅以NMR数据进行确证。由于咖啡酰基取代位置的不同可以引起奎尼酸上H发生相应的特征化学位移改变,仅以1H-NMR数据即可确定咖啡酰基的取代位置,从而确定二咖啡酰奎尼酸类化合物的结构。

在奎尼酸中,3、4、5位氢的化学位移值分别为δ4.09、δ3.39、δ3.99。4-H处于直立键位置,它与处于直立键位置的5-H之间的二面角为180°,偶合常数较大(J=7.3 Hz),而它与处于平伏键位置的3-H之间的二面角为60°,偶合常数较小(J=2.6 Hz),因此,4-H在1H-NMR谱中表现为dd峰。5-H处于直立键位置,与6-H(a)也有较大的偶合常数,而与6-H(e)偶合常数较小,因此,5-H表现为宽的多重峰。3-H处于平伏键位置,与4-H以及2-H(a,e)之间的二面角均为60°,偶合常数较小,所以与5-H相比,3-H分裂为较窄的多重峰。当奎尼酸上的羟基氢被咖啡酰基取代后,同碳上的氢由于咖啡酰基的吸电子作用,化学位移会向低场大幅度移动,化学位移δ值大于5,而羟基氢未被取代的碳上氢的δ移动幅度较小,化学位移δ值小于5[14]。

在化合物2中,较窄多重峰3-H和较宽多重峰5-H的化学位移分别移向低场δ 5.39和5.43处,而dd峰的4-H的化学位移移至δ 3.96,化学位移改变较小;另外化合物2的1H-NMR数据与文献[13]的结果一致,由此判断化合物2为3,5-二咖啡酰基奎尼酸(3,5-DiCQA)。在化合物3中,较宽的多重峰5-H的化学位移移至5.24,3-H及4-H的化学位移分别移至4.08、3.62,改变较小,所以另1个咖啡酰基的取代位置只能发生在奎尼酸1位羟基上,与文献[15]报道的1H-NMR的数据基本一致,确定化合物3为1,5-二咖啡酰基奎尼酸(1,5-DiCQA)。化合物4较宽的多重峰5-H以及dd四重峰的化学位移分别移至5.62、5.12,较窄的多重峰3-H的化学位移为4.38,改变较小,与文献[16]报道的数据一致,确定化合物4为4,5-二咖啡酰奎尼酸(4,5-DiCQA)。在化合物5中,3,4,5-H的化学位移改变趋势与化合物2一致,咖啡酰基的取代位移相同,与化合物3比较,化合物5另有一甲氧基的H谱信号,且在同一色谱条件下化合物5在反相色谱柱上的保留时间远远长于化合物2的,分别为35.56、16.38 min,甲氧基的取代大大降低了化合物的极性,由此确定化合物甲氧基取代发生在奎尼酸的羧基位置,化合物5的1H-NMR数据与文献[15]报道的数据一致,确定化合物5为3,5-二咖啡酰奎尼酸甲酯(3,5-DiCQAME)。化合物2～5的结构式见图1,各自的1H-NMR数据见表1。

图1 菊芋中二咖啡酰奎尼酸类化合物的结构

4 小结与讨论

本实验研究了菊芋叶中的多酚类化学成分,通过多重色谱结合的方法从菊芋叶中分离制备了7个多酚类化合物,并采用UV、MS结合NMR鉴定了分离所得化合物的结构,分别为咖啡酸(化合物1)、3,5-二咖啡酰奎尼酸(2)、1,5-二咖啡酰奎尼酸(3)、4,5-二咖啡酰奎尼酸(4)、3,5-二咖啡酰奎尼酸甲酯(5)、5,8-diOH-6,7,4'-triOMe(pedunculin) (6)、5,8-diOH-6,7diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone(7),其中化合物1～5为酚酸类化合物,化合物6～7为黄酮类化合物,化合物2～7均为首次从菊芋叶中分离获得。另外，对4个二咖啡酰奎尼酸化合物2～5的1H-NMR数据进行了分析，得出了该类化合物咖啡酰基取代位置不同时的特征化学位移。

多酚类化合物具有抗氧化、强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂、增加身体抵抗力、抗辐射等功能,对癌症、糖尿病及心血管疾病等慢性病具有良好的预防作用,因此研究开发多酚类化合物有着广阔的市场前景及重要的现实意义。菊芋叶中多酚类化合物的研究为菊芋成为新的生物资源提供了依据。

表1 4个二咖啡酰奎尼酸类化合物的1H-NMR数据

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(责任编辑:黄荣华)

Extraction, Separation and Structural Identification of PolyphenolicComponents from Leaves ofHelianthustuberosus

YUAN Xiao-yan, FENG Dong-mei, CHEN Xiao-lan

(Department of Analytical Chemistry, School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, China)

The polyphenolic components were extracted from the leaves ofHelianthustuberosusthrough adopting different polarities of solvents, these components were separated and purified by using the normal-phase and reversed-phase chromatographic techniques, and their chemical structures were identified by UV, MS and NMR spectral data analysis. Seven polyphenolic compounds were separated from the leaves ofH.tuberosus, and they were identified as caffic acid (1), 3,5-dicaffeoylquinic acid (2), 1,5-dicaffeoylquinic acid (3), 4,5-dicaffeoylquinic acid (4), 3,5-dicaffeoylquinic acidic methyl ether (5), 5,8-diOH-6,7,4′-triOMe (pedunculin) (6), and 5,8-diOH-6,7-diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone (7). Among them, the compounds 1～5 were attributed to phenolic acids, and the compounds 6～7 were flavonoids. Meanwhile, the replacement places of 2 caffeoyls in 4 dicaffeoylquinic acid compounds could be determined only by1H-NMR data analysis.

Helianthustuberosusleaf; Phenolic acid; Flavonoids; Separation; Structural identification

2016-11-07

遵义医学院博士启动基金资助项目(F-635);贵州省联合基金资助项目(CK-881)。

袁晓艳(1980─),女,山东临沂人,副教授,博士,主要从事药用植物成分研究工作。

R284

A

1001-8581(2017)04-0081-04