IgY在免疫检测及治疗中的应用进展

张 璐，刘珍珍，宁长申，菅复春

(河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002)

IgY在免疫检测及治疗中的应用进展

张 璐，刘珍珍，宁长申，菅复春*

(河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002)

卵黄抗体(IgY)是存在于卵黄中的免疫球蛋白，是鸟类、爬行动物和两栖类动物体内的主要抗体，具有强大的免疫功能。论文介绍了卵黄抗体的分子结构和理化特性，综述了IgY在寄生虫(弓形虫、血吸虫、球虫)、细菌(肠产毒素大肠埃希菌)、病毒(B型流感病毒、狂犬病病毒)等病原检测、抗生素(卡那霉素、庆大霉素)残留检测及相关疾病如雏鸡球虫病、猪大肠杆菌病、鳗鱼弧菌和利斯顿氏菌病、轮状病毒病治疗中的应用，并指出目前IgY应用中存在的诸如可能存在禽类未知病原、尚无生产标准规程以及稳定性不够理想等问题。因卵黄抗体具有安全、高效、无公害的特点，其在疫病检测和防治中具有广阔的应用前景。

卵黄抗体；免疫检测；治疗

卵黄抗体(immunoglobulin of egg yolk，IgY)是指经特定抗原免疫的产蛋鸡产生并浓集储存于卵黄，提取后能够预防和治疗相应疾病的来源方便、成本较低的多克隆抗体。1893年Klemperer首次证明特异性抗原免疫蛋鸡后，抗体会转移到卵黄中；1969年Leslie和ClemIgy提出以IgY表示卵黄中的抗体；20世纪80年代初，Polson A等[1]建立了制备卵黄抗体的有效方法，聚乙二醇提取法。自此以后，利用特异性卵黄抗体进行免疫检测和疾病治疗均取得了颇好的效果。目前，卵黄抗体的应用范围已经扩展到医药卫生、保健品及生物技术等相关领域，应用前景良好。

1 IgY的分子结构及理化特性

卵黄中水分约占48%，蛋白质约占18%，脂类约占30%，其中大部分脂肪与蛋白质以脂蛋白的形式存在。IgY的性质与哺乳动物IgG相似。正常鸡IgY的分子质量约为180 ku，由2条轻链(2L)和2条重链(2H)组成。轻链有1个恒定区和1个可变区，重链有1个可变区和4个恒定区，重链和轻链的分子质量分别为60 ku～70 ku和22 ku～30 ku，IgY的等电点约为5.2。IgY具有良好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热，并具有一定抗酶解能力。IgY在pH 4.0～11.0时比较稳定，pH 3.0～3.5时活性迅速下降，pH12时活性也有所下降。反复冻融对哺乳动物类抗体的抗原结合活性影响较大，但IgY经1次～5次冻融后活性几乎不受影响。IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力但对胰蛋白酶十分敏感。相关研究表明，在pH 1～5之间IgY对胃蛋白酶敏感性随着pH的升高而减弱[2]。从生物学角度来讲，人与鸡的亲缘关系较远，存在人和鸡共患疾病的可能性与机率也较小，因此，与同种或相近动物的IgG相比，IgY有更好的特异性和敏感性。这些特性让IgY比哺乳动物的抗体在相应疾病的预防和治疗方面有着先天的优越性。

2 IgY在免疫检测中的应用

2.1 IgY在寄生虫感染检测中的应用

IgY抗体在弓形虫、血吸虫和球虫等寄生虫感染检测方面已经有了初步的研究和应用。沈荣等[3]报道用白莱航鸡制备并纯化抗弓形虫IgY抗体，以辣根过氧化物酶标记后与抗人IgM单抗配伍建立了捕获ELISA，检测临床病人血样，发现使用IgY确能解决此类试验存在的非特异性反应，并能提高试验的敏感性。Cakir-Koc R等[4]采用ELISA免疫印迹技术测定制备的抗乙型肝炎病毒表面抗原1(surface antigen 1，SAG1)的卵黄抗体活性，结果显示，获得了特异性的抗SAG1抗体。蔡玉春等[5]用日本血吸虫可溶性抗原(soluble egg antigens，SEA)通过两种不同方式免疫蛋鸡获得抗SEA的特异性IgY抗体，并对IgY抗体的产生规律和特性进行了鉴定与分析。吴凯等[6]成功制备并纯化抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen，SEA)的IgY，并以其作为捕捉抗体，建立了双抗体夹心ELISA检测间接红细胞凝集试验(IHA)阳性者尿液中的血吸虫循环可溶性虫卵抗原(circulating soluble egg antigen，CSEA)的方法，这种方法作为一种便捷、无创伤的新方法可应用于血吸虫病的查病工作中。

2.2 IgY在细菌感染检测中的应用

产肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxigenicE.coli，ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原之一。仔猪腹泻的发生与大肠埃希菌的不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)有密切关系。赵姝静[7]通过试验获得重组蛋白LTB-ST1a，免疫产蛋鸡制备的卵黄抗体对LT和ST具有中和作用，该研究为仔猪大肠埃希菌性腹泻的防治提供了有效的特异性防治制剂，同时为大肠埃希菌肠毒素进一步研究提供了检测抗体。

2.3 IgY在病毒感染检测中的应用

流行性感冒是最常见的急性病毒性疾病之一，乙型流感病毒是引起季节性流感局部暴发的主要病原体之一。温俊林等[8]以灭活乙型流感病毒免疫母鸡，分离纯化特异性IgY抗体，通过体内外活性鉴定，获得了高纯度和特异性的抗乙型流感病毒的IgY抗体，该抗体在体内外均有抗病毒活性，在免疫诊断检测中有较高灵敏度，为IgY抗体作为抗流感药物和诊断试剂的应用开发奠定了基础。H7亚型禽流感病毒是禽流感病毒的一种，属于一种高致病性禽流感病毒。IgY在H7亚型禽流感病毒免疫检测中的应用也有报道。徐茂文等[9]采用血凝抑制试验对采集的鸡卵黄样本进行H7亚型禽流感病毒抗体检测，在962份鸡卵黄样本中，有22份为H7亚型禽流感病毒抗体阳性。由此可见，检测卵黄抗体来可作为监测产蛋鸡群免疫或感染状态的一个重要指标。 Bentes G A等[10]报道利用卵黄抗体通过间接免疫荧光法检测到来自猴子的冷冻肝脏中的甲肝病毒并证实了研究的有效性。

2.4 IgY在抗生素残留检测中的应用

抗生素残留是随着农牧业的发展，药物使用不当造成的不良后果。随着人们对食品安全关注度的提高，药物残留检测和监管也成为目前公共卫生和安监部门的主要工作。因抗生素分子质量小，抗原性差，采用合成人工抗原和借助免疫学方法是检测抗生素残留的常见策略。He J等[11]建立了基于IgY抗体的检测食品中卡那霉素残留的ic-ELISA(indirect competitive enzyme-linked immuno -sorbent assay)方法。试验结果显示，针对卡那霉素的IgY抗体与其他药物交叉反应性较低(小于0.01%)，从牛奶、猪肉和鸡粉样品中的回收率在82.02%～98.20%，相对标准偏差低于5.13%。表明抗卡那霉素的IgY抗体可用于食品样品中卡那霉素残留的分析。He J等[12]报道已经研发了高效价的抗庆大霉素的IgY抗体。通过ic-ELISA试验显示，庆大霉素最低检出量为0.01ng/mL，新鲜牛奶，猪肉和鸡肉样本中庆大霉素的回收率在69.82%～94.32%。表明抗庆大霉素的IgY抗体可用于食品样品中的庆大霉素残留的常规筛查分析。

3 IgY在疾病治疗中的应用

3.1 IgY在寄生虫病治疗中的应用

卵黄抗体在治疗动物寄生虫病方面取得了一定的研究成果。Lee S H等[13]等发现，在日粮中添加10%或20%的抗3种球虫(Eimeriatenella、E.acervulina和E.maxima)的IgY，对雏鸡用E.acervulina进行攻毒，能显著减少试验鸡粪便中的卵囊数量，且试验鸡体重增加显著。饲喂低浓度的IgY可使粪便中的卵囊数量明显减少，但对体重增加无影响。马超峰等[14]应用特异性IgY治疗自然感染安氏隐孢子虫的犊牛，结果表明，与阴性卵黄抗体对照组相比，抗隐孢子虫高免卵黄抗体治疗组可以减少安氏隐孢子虫卵囊的排出，降低排卵囊高峰期的OPG值(oocysts per gram feces)。这些研究结果说明用IgY抗体治疗隐孢子虫病是有效的，对于无特效药物的隐孢子虫病来说，用IgY抗体治疗隐孢子虫感染的病人意义重大。

3.2 IgY在细菌性疾病治疗中的应用

IgY作为化学药物替代品用于胃肠道疾病防治，是目前卵黄抗体较为成功和普遍的应用。产肠毒素性大肠埃希菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原之一。程福亮等[15]利用ETEC标准菌株K88、K99、987P和导致仔猪副伤寒的2株沙门菌，制备产肠毒素性大肠埃希菌-沙门菌二联五价灭活疫苗，然后免疫接种待开产母鸡，从而制备出效价较高的卵黄抗体，为预防和治疗仔猪腹泻提供了一条途径。幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，其感染呈世界性流行，严重影响人类健康。将Hp特异性致病因子作为免疫原制备Hp-IgY用于治疗Hp感染，已成为国内外幽门螺杆菌研究的主方向之一，同时也为Hp感染的治疗开辟了一条新路径[16]。

随着水产养殖规模化发展和抗生素的滥用，导致鱼类病原菌逐渐产生耐药性，水体污染也随之加重，这已经间接地危害到人类健康，寻找安全可靠的替代品成为目前畜牧和水产养殖疫病防治的明智选择。Li C等[17]通过试验证明，抗鳗弧菌特异性卵黄抗体对香鱼有良好的被动免疫作用，使用后可有效降低香鱼血液、肝脏和脾脏的病原菌数量。观赏鲤鱼的溃疡病是由非典型杀鲑气单胞菌引起的，它诱发皮肤溃疡，导致观赏鱼毁容进而造成经济损失。Gan H等[18]研制了能预防溃疡的IgY，连续将鱼浸入含有IgY的饲养水中可以完全阻止由于群体同居交叉感染导致的溃疡性疾病，表明使用这种IgY可有效防止这种接触性感染。近年来，由鳗利斯顿氏菌引起的香鱼病害问题越来越严重。程娜[19]研究表明，灌服特异性卵黄抗体对感染鳗利斯顿氏菌的香鱼能够发挥有效的治疗和预防作用。

3.3 IgY在病毒性疾病治疗中的应用

轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起婴幼儿腹泻的重要病原体，采用抗轮状病毒IgY对轮状病毒性肠炎患者进行治疗发现，特异性IgY用于治疗小儿轮状病毒性肠炎具有良好的效果。高运金等[20]报道，将108例轮状病毒检测为阳性的患儿随机均分2组，发现使用抗轮状病毒IgY对对轮状病毒性肠炎总治愈率达89.83%，疗效显著。猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是引起初生仔猪腹泻的肠道病毒性病原体，口服或在饲料中添加抗PEDV的IgY后，仔猪的病死率显著降低[21]。

3.4 IgY在其他疾病治疗中的应用

特异性IgY对婴幼儿、老年人或由于化疗的肿瘤患者等特殊人群具有重要意义。特定基因型的IgY抗体能够应用于发现及检测生物芯片中的药物靶点，并可应用于消化系统肿瘤的靶向治疗[22]。

IgY在治疗蛇毒中的应用也多有报道。地球上现有2 000余种蛇，其中420余种为有毒的蛇，蛇毒中毒是一个重大的公共安全问题，也是容易被忽视的主要热带疾病之一，每年都有人被毒蛇侵害的病例。传统的抗蛇毒血清具有生产成本高、产率低、副作用多等缺点。IgY具有生产成本低、产量大、纯度高、副作用少等优点，可替代传统血清用于治疗蛇毒中毒。因此，IgY是一种极富前景的蛇毒解毒剂资源[23]。

IgY能有效抑制儿童乳牙龋的发生，对龋病有预防作用。抗龋IgY牙膏的应用能降低乳牙龋病的发病率，具有一定的防龋效果，有很好的应用前景。陈洪等将变形链球菌用不同浓度的抗龋齿IgY和添加IgY的牙膏培养，结果显示，抗龋齿IgY和IgY牙膏均能在体外抑制变形链球菌的生长和黏附作用[24]。

IgY甚至还具有治疗肥胖病的潜力。Hirose M等[25]研究了抗脂肪酶IgY对脂肪酶体外活性的抑制作用，发现抗脂肪酶IgY抗体在饮食诱导肥胖的鼠科动物模型上有抗肥胖性能。姜锦鹏等[26]利用猪脂肪组织细胞膜蛋白制备卵黄抗体，并通过不同的试验证实了脂肪组织细胞膜蛋白卵黄抗体可抑制前脂肪细胞增殖、影响脂肪细胞脂肪的合成、诱导脂肪细胞凋亡，为IgY抗体用于肥胖病的治疗提供了依据。

4 IgY诊断试剂和治疗制剂的研发

随着对IgY研究与应用的进行，关于IgY的专利和制剂也逐渐增多。Skriner K[27]申请了IgY应用于腹腔疾病治疗的专利。张龙现等[28]申请了一种防治贝氏隐孢子虫引起的原发病的卵黄免疫球蛋白生物制剂和增强免疫功能的卵黄免疫球蛋白保健品的专利，制备的抗贝氏隐孢子虫病的特异性IgY可直接作用于贝氏隐孢子虫，发挥特异性抑制作用。索勋等[29]申请了一种IgY相关发明专利，此发明构建了禽流感病毒H9N2亚型的HA1基因片段和鸡IgY分子Fc基因片段的融合基因，并将融合基因转染到艾美耳球虫中得到转基因球虫，通过口服方式接种转基因球虫来提高鸡群针对禽流感特异性抗原的免疫反应。徐永平等[30]申请了抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法方面的专利，该专利主要是获得了特异性好、效价高的用于防治黄海希瓦氏菌引起的疾病和免疫学检测的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体。

5 结语

目前的研究显示了IgY在寄生虫、细菌和病毒等病原感染和相应免疫检测及治疗应用的良好前景。鉴于卵黄抗体是一种廉价、安全有效、易获得的抗体，不存在残留和耐药问题，且在治疗相应疾病方面具有安全、高效无公害的优点。因此，在IgY相关制剂的开发和疾病防治方面的应用前景将会越来越广阔，极有可能成为一类普遍应用的生物制剂。当然，这一领域也存在一些问题。首先，卵黄抗体可能带有未知病原，对养禽业存在潜在的威胁，用于禽类疾病治疗时尤其需要注意；其次，卵黄抗体的稳定性也有待加强，这就需要对制剂的剂型进一步研究，开发出性质稳定、效果可靠的不同类型制剂来满足检测或治疗的需求；再者，卵黄抗体生产还未形成标准化规程，尤其是应用于治疗的IgY制品，应当制定严格的产品质量标准，防止通过IgY制剂造成的潜在疾病感染和传播。随着IgY研究与应用的发展，相信未来会有更多更好的IgY产品或制剂应用于畜牧业生产和人类的卫生保健中。

[1] Polson A,von Wechmar M B,Van Regenmortel M H V.Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens[J].Immunol Commun,1980,9(5):475-493.

[2] 高 岭,刘聚祥,杨娜娜.鸡卵黄抗体及其在养猪业中的应用研究进展[J].动物医学进展,2013，34(5):110-114.

[3] 沈 荣,沈心亮,杨 军,等.抗弓形虫IgY抗体在酶免疫试验中的应用[J].兰州大学学报:自然科学版,2001,37(6):76-79.

[4] Cakir-Koc R.Production of anti-SAG1 IgY antibody againstToxoplasmagondiiparasites and evaluation of antibody activity by ELISA method[J].Parasitol Res,2016，115(8):2947-2952.

[5] 蔡玉春,陈家旭,郭 俭,等.日本血吸虫可溶性虫卵抗原经两种免疫途径获得的鸡卵黄抗体IgY动态观察[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2010,298(2):121-124.

[6] 吴 凯,徐明星,杨 燕,等.抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原IgY的制备及初步应用[J].中国血吸虫病防治杂志,2016,28(2):196-198.

[7] 赵姝静.大肠杆菌肠毒素卵黄抗体的制备及其抗毒素特性研究[D].黑龙江哈尔滨:东北农业大学,2013.

[8] 温俊林.抗乙型流感病毒卵黄抗体的制备及其生物活性鉴定研究[D].广东广州:广东工业大学,2012.

[9] 徐茂文,张 华,李 涛,等.贵州省H7亚型禽流感病毒感染的血清学和病原学分析[J].动物医学进展,2015,36(6):159-162.

[10] Bentes G A,Lanzarini N M,Lima L R P,et al.Using immunoglobulin Y as an alternative antibody for the detection of hepatitis A virus in frozen liver sections[J].Memórias do Instituto Oswaldo Cruz,2015,110(4):577-579.

[11] He J,Wang Y,Zhang X.Preparation of artificial antigen and development of IgY-based indirect competitive ELISA for the detection of Kanamycin residues[J].Food Anal Meth,2015,9(3):1-8.

[12] He J,Hu J,Thirumalai D,et al.Development of indirect competitive ELISA using egg yolk-derived immunoglobulin (IgY) for the detection of Gentamicin residues[J].J Environ Sci Health,Part B,2016,51(1):8-13.

[13] Lee S H,Lillehoj H S,Park D W,et al.Induction of passive immunity in broiler chickens againstEimeriaacervulinaby hyperimmune egg yolk immunoglobulin Y[J].Poult Sci,2009,88(3):562-566.

[14] 马超锋.抗安氏隐孢子虫高免卵黄抗体(IgY)制备及其免疫保护和交叉保护性分析[D].河南郑州:河南农业大学,2008.

[15] 程福亮,梁 瑾,陈甜甜,等.鸡抗猪产肠毒素大肠埃希菌-沙门菌二联五价卵黄抗体的变化规律及喷干工艺的研究[J].动物医学进展,2013，34(3):80-84.

[16] 黄志文,李喜芳,张文军.抗幽门螺杆菌卵黄抗体的研究进展[J].广东医学,2014,35(20):3268-3272.

[17] Li C,Lu X,Li D,et al.Passive protective effect of chicken yolk immunoglobulins against experimentalVibrioanguillaruminfection in ayu(Plecoglossusaltivelis)[J].Fish Shellfish Immunol,2014,37(1):108-114.

[18] Gan H,He H,Sato A,et al.Ulcer disease prophylaxis in koi carp by bath immersion with chicken egg yolk containing anti-AeromonassalmonicidaIgY[J].Res Vet Sci,2015,99:82-86.

[19] 程 娜.抗鳗利斯顿氏菌鸡卵黄抗体对致病香鱼保护作用的研究[D].浙江宁波:宁波大学,2014.

[20] 高运金.百贝宁治疗婴幼儿轮状病毒肠炎疗效观察[J].北方药学,2011,8(1):35-36.

[21] Jeon Y S,Park C K,Kim S,et al.Immunoprophylactic effect of chicken egg yolk antibody (IgY) against a recombinant S1 domain of the porcine epidemic diarrhea virus spike protein in piglets[J].Arch Virol,2015,160(9):2197-2207.

[22] 石新丽,杨 靖,王保宁,等.卵黄抗体技术在人类胃肠道疾病诊治中的应用[J].现代预防医学,2013,40(17):3243-3245.

[23] Lee C H,Lee Y C,Liang M H,et al.Antibodies against venom of the snakeDeinagkistrodonacutus[J].Appl Environ Microbiol,2016,82(1):71-80.

[24] 戴万明,陈继庆.学龄前儿童IgY免疫防龋疗效观察[J].中国学校卫生,2011,32(9):1068-1069.

[25] Hirose M,Ando T,Shofiqur R,et al.Anti-obesity activity of hen egg anti-lipase immunoglobulin yolk,a novel pancreatic lipase inhibitor[J].Nutr Metab,2013,10(1):1-6.

[26] 姜锦鹏,赵茹茜,陈 杰.脂肪组织细胞膜蛋白卵黄抗体对猪脂肪组织中凋亡相关基因表达的影响[J].畜牧与兽医,2015(6):41-45.

[27] Skriner K.IgY composition for use in celiac disease:U.S.Patent Application[P].美国专利:201514727152,2015- 11-19.

[28] 张龙现.一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品和应用[P].中国专利:101081299B,2011-04-27.

[29] 索 勋.表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原的融合基因及其应用[P].中国专利:CN201410046883X,2015-8-12.

[30] 徐永平.抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法[P].201510642165.3,2015-12-30.

Advance in IgY Application on Immunodetection and Disease Treatment

ZHANG Lu,LIU Zhen-zhen,NING Chang-shen,JIAN Fu-chun

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan,450002,China)

Immunoglobulin of egg yolk is the major antibody existed in the egg yolk in birds,reptiles,amphibia with a strong immune function.The molecular structure and physicochemical property of IgY are reviewed briefly,an overview on IgY application in immune detection such as parasites(Toxoplasma,schistosome and coccidia),bacteria(enterotoxigenicE.coli),virus(influenza virus B and rabies virus),residual antibiotics(kanamycin and gentamicin) and related disease treatment were presented (such as chicken coccidiosis,colibacillosis in piglets,eels vibrio and Liston's disease,rotavirus diseases).Some problems existed in application were also indicated in this paper,such as unknown possible pathogens in egg yolk,no correspondent production standard and IgY stability can not satisfied the requirement in store and use,and so on.With characteristics of safe,efficient,pollution-free,IgY could be widely and effectively used in disease detection and prevention.

immunoglobulin of egg yolk; immunoassay; treatment

2016-07-04

国家现代肉羊产业技术体系项目(nycytx-39)；国家自然科学基项目(31172311)

张 璐(1991-)，女，河南开封人，硕士研究生，主要从事原虫病分子及免疫诊断研究。*通讯作者

S852.43

A

1007-5038(2017)01-0078-04