胰腺胚胎发育调控机制及胰腺干细胞诱导分化方法研究进展

杨沛霖，吕 灏，赵冬冬，林树梅

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

胰腺胚胎发育调控机制及胰腺干细胞诱导分化方法研究进展

杨沛霖，吕 灏，赵冬冬，林树梅*

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

近年来糖尿病发病率逐年增加，研究如何控制和预防糖尿病成为世界性课题。传统的治疗方法不仅不能从根本上解决高血糖也不能有效地控制糖尿病并发症。胰岛移植技术的出现为临床治疗糖尿病提供了新的途径，但是胰岛数量的不足和胰岛移植出现的免疫排斥反应制约了胰岛移植技术的发展。因此，通过自体胰腺干细胞分化修复胰腺组织从而达到平稳血糖和控制糖尿病并发症成为一种新的技术手段。论文综述胰腺胚胎发育调控机制、胰腺干细胞的定位及体外诱导分化方法等方面的研究进展。

糖尿病；胰岛；胰腺干细胞；体外诱导

随着生活水平的不断提高，营养代谢类疾病的发病率逐年升高，特别是糖尿病的发病率持续升高且愈发年轻化，这种情况同样发生在宠物身上。因此，预防糖尿病和平稳血糖的研究对人类和宠物都有重要的意义。

糖尿病有两种类型，一种为胰岛素依赖型糖尿病，即Ⅰ型糖尿病，另一种为非依赖型糖尿病，即Ⅱ型糖尿病[1]。Ⅰ型糖尿病发病的原因在于分泌胰岛素的胰岛β细胞由于自身免疫造成选择性的不可逆的损伤。Ⅱ型糖尿病发病的主要原因在于高脂高糖饮食及缺乏运动等形成的胰岛素敏感性降低(胰岛素抵抗)，由此造成了胰岛β细胞应激，继而引发β细胞凋亡及胰岛β细胞分泌胰岛素功能下降[2]。Ⅰ型糖尿病患者体内β细胞几乎全部被破坏，Ⅱ型糖尿病β细胞的破坏率大约40%～60%[3]。传统糖尿病的治疗方法主要有两种，一种是注射胰岛素，另一种是通过口服药物刺激胰岛β细胞加大胰岛素的分泌量。虽然两种方法能在一定程度上降低血糖，但是都不能从根本上治疗糖尿病和抑制糖尿病并发症的发生，反而有可能会加大对残存胰岛β细胞的损伤，使病情加重。胰岛移植被认为是治疗糖尿病的有效途径[4]，通过胰岛移植可以取代已经受损的胰岛β细胞，从而有效地降低血糖。因此，体外移植胰岛细胞将成为一种临床治愈糖尿病的新途径。根据世界糖尿病联合会统计显示，使用胰岛干细胞移植的方法治疗糖尿病可能在全球范围内影响到3亿人[5]。

虽然胰岛移植为根治糖尿病提供了希望，但是外源性胰岛细胞的不足和免疫排斥等问题限制了这项技术的发展。但是，诱导多能干细胞(iPS)具有自我更新能力和分化潜能，其功能与胚胎干细胞(ES)类似，因此无需制造胚胎，理论上从任何组织的成体细胞都可制造出具有干细胞功能的细胞，在科研工作中避免了胚胎研究所面临的伦理学问题[6]。因此，干细胞分化成具有分泌胰岛素功能的细胞，用于代替已损伤的胰岛β细胞治疗糖尿病具有很大的发展前景。使用干细胞的方法治疗糖尿病具有吸引力，因为这两种类型糖尿病的发展都是基于胰岛β细胞所分泌胰岛素的缺乏，使用自体干细胞诱导分化的胰岛β细胞代替疗法可以有望从根本上逆转糖尿病。本文将从胰腺胚胎发育调控机制和胰腺干细胞诱导分化方法，对相关研究技术的进展进行介绍。

1 胰腺干细胞

干细胞具有自我复制的能力，以及具有多向分化潜力的一种早期未分化的细胞[7]。干细胞在特定条件之下，可分化为各种不同的功能性细胞，继而分化成多种不同的细胞与组织器官。干细胞按照分化阶段的不同，大致可以分为2种，即胚胎干细胞与成体干细胞。胚胎干细胞可以分化成体内的任何一种细胞，包括3个胚层的所有细胞[8]。成体干细胞与胚胎干细胞相比具有较低的增殖、分化和组织再生能力。胰腺干细胞一般是指未达终末分化状态,能产生胰岛组织或起源于胰岛,具有自我更新复制能力的未定型细胞。

2 胰腺干细胞的存在位置

许多研究表明β细胞前体细胞主要存在于胰腺导管。导管细胞分化成的胰岛缓慢替代更新胰岛细胞。研究表明，Ⅰ型糖尿病和部分切除胰腺的啮齿类动物，胰岛样聚合体产生于导管组织丰富的人的胰腺组织和小鼠胰腺导管，这些胰岛样聚合物在葡萄糖刺激后产生释放胰岛素和表达胰岛标志蛋白[9]。据报道，异位基因Ngn3的表达是人体胰腺内分泌发育的关键信号，将Ngn3定向破坏之后，将出现所有胰腺内分泌细胞的缺乏，且有试验通过检测Ngn-3的表达结果证明胰腺导管上皮细胞和胰岛细胞可以转变为胰岛素表达细胞[10]。另外，通过体外试验结果表明表皮细胞生长因子和胃泌素结合可以诱导胰腺导管内的导管细胞和腺泡细胞分化成胰岛β细胞，使功能性胰岛β细胞数量大量增加[11]。由此可知，胰腺干细胞存在于胰腺的导管、腺泡细胞和成熟的胰岛中。

3 胰腺的胚胎发育及调控

胰腺在发生上起源于内胚层，是由内分泌腺和外分泌腺组成的器官，其中外分泌腺80%由导管和腺泡细胞组成。外分泌腺腺泡细胞分泌各种消化酶进入消化道，参与营养物质的消化吸收,而内分泌细胞分泌各种激素进入血液循环，调节体内血糖和营养物质的代谢平衡。胰岛细胞有5种类型，即alpha、beta、delta、epsilon和PP细胞，它们分别合成分泌胰高血糖素、胰岛素、生长抑制素、胃饥饿素和胰多肽[12]。

胰腺最初在前肠和中肠交界处由原始内胚层以出芽的方式开始发育。胰腺组织发育可以分为两个阶段，即其一是确定和构成内胚层，其二是胰腺上皮细胞和内分泌/外分泌细胞的定向分化[13]。胰腺所有的细胞类型都起源于前肠的十二指肠上部区域的内胚层细胞[14]。胰腺由腺泡细胞、导管上皮细胞和胰岛细胞等胰腺前体细胞从定型内胚层开始发育[13]。定型内胚层在原肠胚形成期间出现，这个过程开始时外胚层细胞受到Wnt和Nodal信号介导，经历上皮细胞向间质细胞的转变从而形成原条。随后，为了驱使定型内胚层形成，原条最前端的区域暴露在高浓度的Nodal信号因子中，与此同时，原肠形成。在原肠管中形成内胚层褶皱，并分为3个区域，即前肠、中肠和后肠，这些区域都是通过附近的组织分泌的生长因子诱导形成的。前肠末端腹侧近肝憩室尾缘的内胚层上皮增生向外突出形成腹胰芽，同时其对侧上皮也发生增生形成背胰芽[15]。这种模式使不同组织肉芽沿原始肠管发育。2个胰腺组织肉芽中的同源盒表达基因PDX-1在前肠发育后期表达。PDX-1基因表达的细胞的分化使肠管背侧和腹侧外翻形成2个上皮组织的分支[16]。转录因子胰十二指肠同源异形盒基因 (pancreas duodenal homeobox-1，PDX-1)和胰腺特异性转录因子(pancreas specific transcription factor，Ptfla)诱导胰腺生成[17]。PDX-1是一种包含同源结构域的转录因子，在人类胚胎发育的第5周和小鼠胰腺前体细胞发育的第8.5周出现[18]。导致胰腺发育不全的试验证明，胰腺在发育过程中PDX-1是最重要的转录因子之一[19]。研究显示PDX-1不仅是胰腺前体细胞发育初期的有效标记物，而且对胰腺干细胞分化为分泌胰岛素的β细胞也是至关重要的；Ptf1a失活的胰腺前体细胞可以转化成小肠上皮前体细胞；转录基因表达产物PDX-1作为Ptf1a的启动子在小鼠PDX-1抑制试验中显示其能恢复胰腺组织发育[20]。由此可以看出，PDX-1和Ptf1a对胰腺的发育至关重要。

在胰腺胚胎发育阶段，一些信号分子起到了关键的调控作用，其中背动脉和脊索分泌信号分子维甲酸影响背芽发育，心脏间质和侧板中胚层分泌信号分子骨形态发生蛋白(Bmp)影响腹芽发育。一些胰腺发育功能缺失的动物模型显示维甲酸信号对胰腺形成是必不可少的[21]。此外，小鼠胚胎试验证明在腹芽上的Bmp可以抑制PDX-1的表达从而抑制胰腺的发育，在鸡胚试验中表明脊索音猬因子(Shh)的抑制作用对胰腺的发育非常重要[22]。最终肠管扭转将腹芽和背芽融合在一起形成胰腺原基，并且扩散到周围间质中。腹胰芽和背胰芽不断地增生和分支，分别形成独立的内外分泌腺组织，腹胰和背胰相互融合形成胰腺。胰腺间质通过分泌FGF10等因子为胰腺上皮细胞的增殖和分化提供一个宽松环境，并且保持Notch的活性。随后，大量的成体干细胞因子PDX-1、Nkx6-1和Ptf1a的表达证明形成了内分泌和外分泌细胞。PDX-1和Nkx6-1二者在外分泌腺导管的祖细胞中表达，Ptf1a为腺泡细胞表达标志物[23]。在胚胎期，导管细胞、外分泌腺泡细胞和内分泌胰岛细胞的分化是从原始导管样细胞开始的。在发育过程中，胰芽反复分支，形成各级导管及其末端的腺泡，一些小导管的管壁上皮细胞游离进入间充质，分化为胰岛。胰岛细胞来源于胰腺导管上皮的干细胞，而这些干细胞能够分化成为胰岛内分泌细胞。胚胎期胰腺再生来自于未分化的祖细胞或者干细胞，在出生后阶段，胰岛内分泌细胞团的每一次扩增都必须通过已存在胰岛细胞有限的增生，但是腺泡和导管细胞仍然保有显著的增生活性，保证细胞的更新和生长，在特定条件下，也能转化为分泌胰岛素的β细胞。

4 胰腺干细胞的体外诱导分化

早期胰腺干细胞体外诱导分化的方法主要由Lumelsy N等提出：①将胚胎干细胞诱导形成胚状体(embryoid bodies，EBs)；②将EBs置于添加了ITSFn(胰岛素、转铁蛋白、硒盐、纤维连接蛋白)的无血清培养基中生成巢蛋白阳性(nestin+)细胞；③将这些nestin+细胞置于添加了分裂素、B27和bFGF的N2无血清培养基中培养；④撤去分裂素终止细胞分裂，加入尼克酰胺促进细胞分化；⑤最终得到的细胞表达胰岛素及其他一些胰腺内分泌激素，并且形成与正常胰岛类似的三维细胞团结构等五个阶段诱导小鼠胚胎细胞分化为具有分泌胰岛素功能的细胞[27]。但是有研究证实Lumelsy N的五阶段诱导方法并不成熟，这种方法培养出的细胞产量不高只有10%～30%的细胞为胰岛素阳性。Bose B等[25]将Lumelsky的五步法最后一步加以改良，诱导出的细胞有65%分泌胰岛素，而且移植后可以改善糖尿病鼠长达3个月的血糖水平。

目前，诱导胰腺干细胞分化成功能性的胰岛素分泌细胞的方法有化学诱导法和转基因诱导法。化学诱导法通常是通过添加碱性成纤维细胞生长因子、激活素A、β细胞素、尼克酰胺及胰高血糖素样肽1等生长因子诱导胰腺干细胞分化成功能性胰岛素分泌细胞。近年出现的三维立体的培养方法对细胞的培养条件进行了优化，大幅度提高了胰腺干细胞的诱导率[26]。Shih H P等[27]将含有基质胶(matrigel)形成的立体培养基中加入小鼠未成熟的胚胎胰腺芽，培养3 d后发现胰芽明显膨胀并且发育出分支，为形成诱导性多能干细胞提供了新的方法和思路。Khorsandi L等[28]利用3D的培养方式对大鼠骨髓间充质干细胞进行诱导，3D培养方式诱导所得的胰岛素分泌细胞与2D的培养方式相比高3倍～5倍，并且对葡萄糖刺激产生反应。

基因诱导方法是利用基因工程技术将与β细胞发育和功能相关的基因导入干细胞，使其定向诱导分化的方法。有人尝试通过体外超表达PDX-1、NGN3和MafA诱导所得到的细胞团，与β细胞形态相似且表达β细胞的分子标记，也可以逆转糖尿病小鼠的高血糖状况[26]。

综上所述，胰腺干细胞是一种能分化成胰腺组织的成体干细胞，它主要存在于胰腺的导管上皮细胞、腺泡细胞和成熟的胰岛中，其标志物主要有PDX-1、Ptf1a、Nkx6-1和nestin等。胰腺干细胞具有分化成功能性胰腺组织的能力，移植由胰腺干细胞诱导分化的胰岛细胞，有望修复受损胰腺组织，恢复胰岛细胞的功能。

虽然诱导胰腺干细胞修复胰腺和胰岛具有很大的潜力，但在对胰腺干细胞研究的过程中也出现了很多问题，例如，现有研究表明成熟的胰腺组织中胰岛β细胞是通过自身复制增殖而不是来自于胰腺干细胞的分化。因此，对胰腺干细胞的分化还需进行深入研究，如在胰岛β细胞功能降低的情况下，如何诱导胰腺干细胞分化为成熟的胰岛β细胞将是未来需要解决的关键问题，以及明确胰腺干细胞的分化及分化后可能带来的不良反应，以确保干细胞技术的安全性。

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Progress on Regulation Mechanism of Pancreatic Embryonic Development and Differentiation of Stem Cells

YANG Pei-lin,LÜ Hao，ZHAO Dong-dong，LIN Shu-mei

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning,110866,China)

At present,the incidence of diabetes has increased year by year,how to control and prevent diabetes is becoming a worldwide subject.The traditional treatment method can not only solve the problem of hyperglycaemia,but also can not control the diabetic complications effectively.Although the technologies of islet transplantation provide a new way,the deficiency of the islets and the immune rejection in islet transplantation have restricted the development of islet transplantation.Therefore,it has become a new technique to repair the pancreatic tissue by the differentiation of pancreatic stem cells(PSCs) and achieve stable blood glucose and control the diabetic complications.In this paper,the development regulation mechanism of pancreatic embryos,the localization of pancreatic stem cells and the methods of inducing differentitationinvitrowere reviewed.

Diabetes; hyperglycemia; pancreatic stem cell; inductioninvitro

2016-08-22

国家自然科学基金项目(31572481)

杨沛霖(1990-)，男，辽宁铁岭人，硕士研究生，主要从事基础兽医学研究。*通讯作者

R587.1；S852.1

A

1007-5038(2017)02-0098-04