多重环介导等温扩增技术的研究进展

李森，王源升，余红伟，李瑜

1.海军工程大学 舰船工程系，湖北 武汉 430033；2.海军工程大学 理学院，湖北 武汉 430033

多重环介导等温扩增技术的研究进展

李森1，王源升2，余红伟2，李瑜2

1.海军工程大学 舰船工程系，湖北 武汉 430033；2.海军工程大学 理学院，湖北 武汉 430033

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新型的核酸放大扩增技术。但是，当前的LAMP技术多是在同一个体系中对单一目标物进行检测，限制了其工作效率的发挥。多重LAMP技术就是在同一反应体系中加入多组针对不同靶基因的特异性引物，从而实现对多种目标基因同时进行扩增。我们针对多重LAMP的优缺点，对其在病毒、细菌、寄生虫以及性别筛选等领域的应用做简要综述。

多重环介导等温扩增；快速检测；致病微生物

1 LAMP技术的基本原理及局限性

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸放大扩增技术，由日本荣研公司研究人员所发明[1]。和传统的PCR方法相比，LAMP引物可以识别靶基因序列上的6个特异性区域。内引物FIP由F1c和F2区域构成，F2区域和靶基因序列的F2c区域完美互补；BIP由B1c和B2组成，B2区域与靶基因的B2c区域完美互补；内引物与靶基因的响应区域杂交结合后，在Bst聚合酶的作用下开始链的合成，由此触发环介导等温扩增反应；接下来，外引物F3/B3分别与F3c和B3c结合，各自合成出1条单链进而置换出内引物合成的2条单链，由于这2条链的5′端各自有互补的区域，因此各自会形成一个环状结构；随后在另一条外引物的作用下，另一端也形成一个环状结构，由此形成了LAMP反应的初始哑铃结构[2]。

通过以自身结构为模板，以3′端的F1区域为起点，内引物的F1c区域与哑铃结构的F1区域结合，F2区域和F2c区域结合，由此触发循环链置换放大扩增反应，同样BIP与哑铃结构的另一端茎环结构的B2c区域互补，启动下一轮扩增放大。由此周而复始，至LAMP反应结束，扩增体系里产生了大量由相同特异性序列的反向重复片段组成的DNA片段混合物。除了4条内引物之外，环引物的加入可以加快反应的扩增速率，但并不是LAMP反应所必需的[3]。环介导等温扩增的扩增效率使得扩增产物在15～60 min就可以达到初始模板量的109～1010倍[4]。

LAMP的扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，由于LAMP产物是大小长短不一的重复序列，因此可以观察到大小不同的阶梯条带。产物的终点检测还可以通过加入Sybr GreenⅠ、HNB等核酸染料来进行观察。由于LAMP的扩增过程中会产生大量焦磷酸根，加上反应体系中存在的镁离子，可以形成肉眼可见的白色沉淀[5]，据此荣研公司发明了基于此原理的浊度仪，从而实现了LAMP反应的实时观察检测。除此之外，基于生物发光技术、双链嵌入式荧光染料和荧光修饰探针等技术都可以实现实时LAMP检测[6]。

LAMP技术具有快速准确、简便高效、特异性强及扩增产物检测方便的特点，可广泛用于细菌、病毒、真菌、寄生虫的筛选识别等领域[7-10]。但是，LAMP技术多在同一个体系中对一个目标物进行检测，限制了其工作效率的发挥和检测范围的扩展。多重LAMP技术就是在同一反应体系中加入多组针对不同目标基因的特异性引物，克服了LAMP一次反应只能检测一种目标物的局限，从而对多种目标基因同时进行扩增，有效提高了检测效率，扩展了检测范围，节约了检测成本。

2 多重LAMP（m-LAMP）技术的应用

2.1 多重LAMP技术在病毒鉴定中的应用

LAMP技术发明之后就广泛应用于病毒的筛选鉴定。流感病毒每年冬春季节会引起3～8周的大面积传播，传染性强，传播迅速，持续时间长，具有很高的发病率和死亡率。由于各种流感病毒的发病症状都很类似，发病程度从温和的上呼吸道感染到全身性肺炎症状不等，因此难以区分不同的毒株，须借助于实验室化验来进行病原分析，所以很有必要发展一种快捷有效地区分不同流感病毒的检测技术。Mahony[11]提出了一种m-LAPM技术来实现对A型流感H1、H3和B型流感病毒的快速诊断。此研究设计了3套引物分别针对A型流感的2个亚型H1、H3和B型流感病毒的保守序列，通过实时荧光和熔解曲线来实现对这几种流感病毒的区分。

小麦黄花叶病毒、土传小麦花叶病毒和中国小麦花叶病毒是常见的小麦病害，为了检测这3种小麦病毒害，需要一种精确有效的检测方法。一些传统方法已被应用，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和RT-PCR。虽然ELISA经济有效，但费时费力，检测限较低。RT-PCR灵敏度高、特异性强、操作简单，但需要纯化和从样品中提取RNA，在一定程度上限制了其应用推广。Fukuta[12]等发展了一种新颖的RT-LAMP技术，通过监控核酸扩增和退火过程的实时荧光变化来同时检测这3种病毒。病毒RNA的提取纯化在RT-PCR的分析中是很重要的一步，费事费力且步骤繁琐。由于LAMP扩增所需的Bst聚合酶不易受植物组织提取物的抑制，因此样品的初步RNA提取物即可用于RT-LAMP。多重RT-LAMP检测结果表明，不同病毒的熔解曲线呈现不同的熔解温度峰值，由此可以分析鉴定这几种不同的病毒。

口蹄疫病毒是一种急性传染性病毒，可以感染家养反刍动物、猪和超过70种野生动植物。Yamazaki[13]建立了一种典型的实时荧光多重RTLAMP分析方法用于检测口蹄疫病毒，第一次报道了RT-LAMP方法可用于高序列变异性的RNA病毒的检测。为了克服遗传多样性，该体系将新设计的4套引物与之前报道的2套引物结合起来检测口蹄疫病毒。通过实时浊度仪，将300个样本的扩增结果与RT-PCR结果进行对比，RTLAMP的灵敏度明显优于RT-PCR方法。

呼吸道合胞病毒（RSV）是年轻人和老年人上下呼吸道感染的主要诱因，也是未满2岁的婴儿罹患毛细支气管炎和下呼吸道感染的最重要的一个原因。成人感染RSV的症状通常是温和的，但老年人和免疫功能严重低下的患者感染之后会导致病情恶化。Mahony[14]建立了m-LAPM方法快速检测A、B亚型RSV。分别针对RSV的矩阵基因和B亚型RSV的聚合酶基因设计了6条引物，观察实时荧光曲线和熔解温度曲线来进行扩增产物的分析鉴定。通过对275个鼻咽组织样本的测试，将m-LAMP技术与PCR进行了对比。优化后的m-LAMP方法平均扩增时间仅为14.2 min，而PCR需要90～120 min。通过样本处理制备，大概30 min即可完成RSV的检测。本方法快速便捷，是目前已知最快的针对RSV的检测方法。今后通过与微流控技术相结合，可以快速应用于临床检测等领域。

Liu[15]建立了一种m-LAPM方法，可同时检测2种菊花致病病毒CVB和CSVd，检测限只有传统PCR方法的1/1000。此方法不仅可以对致病病毒的感染情况进行监测，也可以快速启动控制流行病毒传播的应急措施。

2.2 多重LAMP技术在细菌鉴定中的应用

细菌的筛选鉴定在临床检验中具有重要意义，约78%的上呼吸道感染者在送诊后受到不恰当的抗生素治疗，相信抗生素可以预防继发性细菌感染，但80%的上呼吸道感染却是由病毒引起的，而抗生素对于病毒引起的上呼吸道感染并没有什么用。更重要的是，抗生素的滥用提高了细菌的耐药性，导致越来越多耐药细菌的出现。因此，通过有效方法实现对细菌引起的上呼吸道感染的定性和定量分析是至关重要的。Luo[16]创造性地结合LAMP和微流控芯片技术，以特异保守基因为检测对象，建立了单重、多重、定性、定量和集成LAMP微流控芯片，并应用于肺炎杆菌、甲型流感病毒和肺结核杆菌等重大传染性病原体的快速诊断和分型。该系统将来有望应用于上呼吸道感染的快速诊断鉴别，从而有效减少抗生素的滥用。

产志贺毒素大肠杆菌是一种引发胃肠道疾病的致病菌，感染后可能会导致危及生命的后遗症，因此，志贺毒素基因stx1和stx2一直是检测的重点。Yoshihiro[17]发展了一种双重LAMP检测策略用于检测产志贺毒素大肠杆菌的stx1和stx2基因。stx1基因的一条引物标记了荧光基团，另一个基因stx2的引物未标记。基于FRET的原理，如果stx1基因序列被大量扩增，荧光标记的引物与嵌入型染料溴化乙锭结合，导致荧光降低，而stx2基因序列扩增时游离溴化乙锭大量减少，体系中的荧光增强，由此可用于stx1和stx2基因的检测。

引起腹泻的食源性胃肠疾病是一个世界性公共卫生问题，而其中大部分都是由沙门菌和志贺菌引起的。Shao等[18]建立了一种m-LAMP方法，用于对牛奶中的沙门菌和志贺菌进行同时检测。在此实验体系中，分别针对沙门菌的invA基因和志贺菌的ipaH基因设计了2套引物。与传统的PCR方法1 pg DNA/反应的检测限相比，此方法对沙门菌和志贺菌基因组DNA的检测限低至100 fg DNA/反应。

酵母菌常用于食品和饮料的发酵，但它们也可能导致食物腐坏。食品腐坏是食品行业的一个严重问题，为了避免潜在的健康危害，快速准确地检测致病菌是食品工业对消费者的一项重要责任。Kasahara[19]开发了同时检测3种致病性酵母菌的m-LAPM反应体系，实验结果显示了在同一反应体系中，在相同的引物浓度条件下，多重引物的扩增速率一般情况明显慢于单重LAMP条件下的扩增速率，由此发现引物之间的相互干扰在一定程度上影响了等温扩增反应的进行。在m-LAPM反应体系中，对单一菌株目标DNA的检测灵敏度与单重LAMP体系相当。

2.3 多重LAMP技术在寄生虫检测中的应用

虫媒传染病，如疟疾和丝虫病，在世界上大部分地区广泛流行并威胁人类的健康。蚊子是寄生虫、细菌和病毒等各种致病性病原体的重要载体，会感染包括人类在内的多种宿主。但一只蚊子体内可以携带多种致病性病原体，需要快速高效地得到同时检测。Aonuma[20]通过设计荧光标记引物，利用m-LAMP方法实现了对波格鼠疟原虫和犬恶丝虫的同时检测。

牛贝巴虫病是在一种在热带和亚热带地区广泛传播的重要蜱传类疾病，主要由2种牛红细胞内的原生动物寄生虫牛贝巴虫和牛双芽巴贝斯虫引起。虽然这2种寄生虫引起的临床症状相似，表现为发热、贫血和黄疸，但牛贝巴虫引发的症状远比牛双芽巴贝斯虫的更严重。急性感染寄生虫病通常通过血涂片镜检确诊，而亚临床感染应通过血清学进行鉴定。传统PCR方法也显示了较高的效率和灵敏度，但需要昂贵的仪器和专业技术人员。Iseki[21]开发了2套针对牛贝巴虫和牛双芽巴贝斯虫的引物，并加入了限制性内切酶位点，在扩增完成之后进行酶切实验即可实现对这2种寄生虫的区分。

2.4 多重LAMP技术在性别鉴定中的应用

在畜牧业中，胚胎移植前的性别鉴定有利于增加所需性别的动物数量。Khamlor[22]分别针对2块不同的染色体区域设计了2套引物，S4区域是雄性胚胎Y染色体所特有的，另一块区域是雌雄胚胎所共有的，被用来作为内部控制，以确保检测的准确性和可靠性。S4区域的环引物特别修饰了荧光染料ROX，而共有基因区域的2条环引物都修饰了FITC染料。此研究在反应管的盖子上放置了阳离子聚合物，反应后摇匀即可显色，绿色沉淀表明只有控制DNA存在，没有Y染色体，而橙色沉淀表示这2个目标基因都存在。本方法不需要复杂的仪器，通过显色反应即实现了对雌雄胚胎的肉眼检测。

对植物的育种与产果，性别决定是最重要的因素之一。番木瓜的性别类型可分为雌雄同体、雄性和雌性。雄花不结果实，与雌雄同体相比，雌花的果实比较少肉，而且包含更多的种子。为了确保作物的经济价值，就需要产出更多的雌雄同体植株。但由于显性纯合致死，全部雌雄同体的番木瓜种子也不可能存在。因此，Hsu[23]针对6个雄性-雌雄同体的特异标记物开发了m-LAMP技术，可以有效精确地筛选在幼苗期或生长前期的雌雄同体个体。

3 结语

LAMP技术以其方便快捷、简便高效、特异性强及扩增产物检测方便的特点，近年来得到广泛应用。m-LAPM技术在传统LAMP技术的基础上，实现了在同一体系中对多个目标物的同时检测。但是，m-LAPM由于反应体系存在多种特异性引物，不可避免地产生了引物间互相干扰等问题。同时，由于敏感度极高，假阳性问题也极其容易出现。

随着与微流控技术、芯片实验室和毛细管实验室等微型实验室技术的结合，m-LAPM的反应体系也越来越微型化和自动化[24-25]。微型实验室技术在加样、样本提取、反应体系构建等方面的优良特性，为m-LAPM技术提供了技术支撑，未来m-LAPM技术也将朝着更少试剂消耗、更多样本加载和更低检测下限的方向发展，在一定程度上也将大大降低非特异性扩增和核酸污染的几率。以LAMP技术为基础的新型核酸放大检测将有更高的可靠性及更广阔的应用前景。

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Development of the Multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology

LI Sen1,WANG Yuan-Sheng2*,YU Hong-Wei2,LI Yu2
1.Department of Naval Architecture Engineering,Naval University of Engineering,Wuhan 430033;2.College of Science,Naval University of Engineering,Wuhan 430033;China

Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）is a novel nucleic acid amplification technique.The present LAMP method employed a set of primers which recognize a total of six regions of the target DNA.In the multiplex LAMP reaction system,many sets of LAMP primers were designed to specifically detect target genes. This paper focused on the application of multiplex LAMP in the detection of virus,bacteria,parasites and sex se⁃lection.

multiplex LAMP;rapid detection;pathogenic microorganisms

Q81

A

1009-0002（2017）02-0217-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.030

2016-09-01

李森（1989-），男，博士研究生

王源升，（E-mail）qianxun8965@163.com

*Correspinding author,E-mail:qianxun8965@163.com