PASTA-eSTK对细菌调节作用研究进展

林思彤，刘晓琳，孙 磊，沙金丹，刘耀川，张德显，刘明春

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

文献综述

PASTA-eSTK对细菌调节作用研究进展

林思彤，刘晓琳，孙 磊，沙金丹，刘耀川，张德显*，刘明春

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

细菌体内的磷酸化蛋白可以使多种氨基酸如组氨酸、半胱氨酸、丝氨酸等发生磷酸化，对蛋白进行修饰，进而调节菌体生长、毒力和耐药等多种生理学功能。eSTK是位于细菌细胞膜上的一种磷酸化蛋白，具有与真核生物细胞内相似的催化反应区和细菌所特有的胞外区，这个胞外区域被称为PASTA。近年来发现，PASTA-eSTKs能够调节细菌菌体内多种物质的合成以及生命活动，包括细菌细胞壁的合成、细胞形态、细胞分裂和孢子的形成等，但在细菌的进化过程中，不同细菌产生了特有的蛋白磷酸化调节机制，因而，PASTA-eSTKs在不同的菌体所表现出来的作用也有一定差异。论文就eSTKs通过PASTA对细菌分裂等方面的调节作用进行综述，为探讨该蛋白激酶对细菌细胞分裂和形态调节作用机制提供参考。

PASTA-eSTKs；蛋白磷酸化；细菌细胞分裂；信号转导

20世纪50年代以来，蛋白磷酸化被认为是调节生物细胞生理生化功能的重要机制之一[1]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine and threonine kinases，STKs)是真核细胞内蛋白质磷酸化的重要机制，近年来，研究发现这种机制也广泛存在于原核细胞如细菌菌体内。真核生物细胞内蛋白磷酸化通常发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基；而细菌内的蛋白磷酸化则主要发生在组氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和精氨酸残基上，而较少发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基[2]。虽然发生蛋白磷酸化的氨基酸残基存在差异，但是真核细胞和细菌的蛋白磷酸化酶的结构具有高度的相似性[3]，因此也将细菌内的蛋白磷酸化酶称为真核样丝氨酸/苏氨酸激酶(eukaryotic-like serine and threonine kinases，eSTKs)。

eSTKs对细菌的毒力、细胞分裂和形态等多方面能够产生影响[4-5]，而这种作用的产生依赖于激酶的保守催化区域和可变的子区域，后者包括醌类结合区域和类LuxR家族区域等[6]。这些可变区域的功能目前尚不清楚，推测可能与eSTKs的活化和/或对底物识别的特异性有关。某些细菌的eSTKs的可变区包含有能够与β-内酰胺类抗生素结合的青霉素结合蛋白和丝氨酸/苏氨酸激酶连接区(penicillin binding proteins and STK-associated，PASTA)，PASTA也存在于青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)的C末端[7]。eSTKs的PASTA与细菌细胞的分裂和形态调节密切相关[8]。本文就PASTA-eSTKs对细菌调节的作用进行综述。

1 PASTA-eSTKs的结构

PASTA-eSTKs主要包括胞质内结构和胞外结构，关于前者的研究最早出现在结核杆菌菌体内[9]，而胞外PASTA的结构已经在结核杆菌的PknB和金黄色葡萄球菌的Stk1中发现[10]。本文主要以结核杆菌中的PknB和金黄色葡萄球菌中的Stk1为例，来阐明PASTA-eSTKs的结构特征和激活过程。

1.1 PASTA-eSTKs的胞质结构域

PASTA-eSTKs的胞质内结构域由激酶催化区域和近膜区域组成[11]。近膜区域的氨基酸序列容易发生变化，且受到激酶催化区域的影响，其与细胞膜的接近程度也会发生变化[12]，但该区域的具体作用尚不清楚。结核杆菌PknB近膜区域中的2个苏氨酸残基被磷酸化之后，能够活化PASTA-eSTKs，推测此区域能够与苏氨酸的底物进行进行特异性结合，并能够诱导结核杆菌PknB近膜区域的苏氨酸发生磷酸化[13]。

Young T A等[14-15]最早进行了结核杆菌PknB结构域的研究，尽管该蛋白跟真核细胞STK的氨基酸序列的相似率只有30%左右，但是PknB含有维持STK活性的主要氨基酸序列，包括PknB的N末端的β-折叠和C末端的螺旋结构。此外，PknB的N末端也包含一些α螺旋，能够影响该蛋白的催化活性，同真核生物一样，细菌体内的ATP能够结合在N末端的β-折叠和α螺旋之间的可变区，证明细菌和真核生物都具有保守的ATP结合区[16]。

1.2 PASTA-eSTKs的胞外结构区

PASTA-eSTKs的胞外结构区包含多个PASTA基序，且不同的细菌含有的PASTA超二级结构体的数量也不相同，如棒状链霉菌的PASTA-eSTKs仅含有1个PASTA超二级结构体，而惰性真杆菌中则含有7个PASTA基序。发现链霉菌PknB的4个串联重复序列和能够连接肽聚糖的PBPs C末端具有高度同源性，并命名为细菌的eSTKs的PASTA基序[17]。PASTA超二级结构体的结构最早在肺炎链球菌的PBP2X上得到证实，PBP2X包括两个PASTA基序，每一个PASTA包含一个由3个β-折叠和1个α螺旋组成的球状体[18]。随后证实，结核杆菌的PknB和金黄色葡萄球菌Stk1与肺炎链球菌PBP2X中的具有相似的PASTA基序，但是PASTA基序的氨基酸序列具有较大差异[8]。氨基酸序列的差异提示细菌的真核样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶胞外结构区的具有较高的可变性，因此多种外界因素能够影响细菌的生长和细胞形态，但具体的机制仍需要进一步的研究。

1.3 PASTA在细菌eSTKs活化过程中的信号传导作用

青霉素结合蛋白的PASTA和细菌eSTKs的PASTA结构上具有相似性，而β-内酰胺类药物能够与PBPs的PASTA区域结合[10]，因此，推测细菌eSTK的PASTA也能够与β-内酰胺类药物结合。真核生物体中，STKs的受体跟配体结合后而使该酶活化，细菌eSTKs则是通过与胞壁肽结合形成二聚体，活化此蛋白激酶。因此，细菌eSTKs的PASTA部分可以感应细胞壁是否受损，而将此信号传导至细胞内，并由此而产生一系列的磷酸化作用，影响菌体的生长和形态等生物学特征。在细菌培养液中加入胞壁肽可以促进细菌产生孢子，而缺乏STKs的菌株则不能产生孢子，而细菌的eSTKs的PASTA能够结合胞壁肽[19]，提示细菌孢子的产生是由于eSTKs的PASTA与胞壁肽结合之后，引起细菌菌体内一系列生物学变化，促使细菌产生孢子，进而抵抗外界恶劣的生存环境。研究发现,某些细菌eSTK的PASTA是单体结构，不能够与胞壁肽形成二聚体结构[17]。随着研究的深入，发现虽然这些细菌eSTKs的PASTA是单体结构，但是该蛋白激酶跨膜区可感应外界环境中的胞壁肽的浓度，促进此胞外PASTA单体结构的二聚体化，进而活化eSTKs[20]。此外，StkP和PknB的PASTA能够影响激酶在细菌菌体表面的位置，如PASTA的二聚体化可使StkP更倾向于集中于杆菌菌体的中部，而促使PknB出现在杆菌的两端[21]。总之，细菌eSTKs的PASTA结构能够与菌体细胞壁的成分相互作用，活化eSTKs，进而调节菌体的多种生理活动。

2 PASTA-eSTKs的生物学作用

PASTA-eSTKs能够调节细菌细胞壁的合成，影响细胞形态、细胞分裂和孢子的形成等，但是在不同的菌体所表现出来的作用也有一定差异，可能是由于细菌在进化过程中，不同菌种产生了特有的蛋白磷酸化调节机制。因此，本综述主要对目前研究比较多的结核杆菌和金黄色葡萄球菌来阐明PASTA-eSTKs的生物学作用。

2.1 PASTA-eSTKs在结核杆菌中的作用

结核杆菌eSTKs PknA的过表达能够影响菌体形态，进一步研究发现，该菌的PknA和PknB对菌体的形态具有重要的调节作用，且PknA和PknB的过表达会使细菌的菌体呈现短而圆的形态，而这两个基因的不表达会导致菌体出现相反的细菌形态[22]。Wag31与细菌的细胞分裂有关，Wag31被PknA磷酸化以后调节杆菌两端的肽聚糖的合成，而中间部分的肽聚糖合成受到抑制，进而促使细菌形成短圆形的菌体[23]。在结核杆菌菌体内，PknB能够使PknA发生磷酸化，因此，这两种eSTKs能够通过一系列复杂的信号调节系统使菌体内的细胞分化蛋白发生磷酸化，来调节菌体的生长和菌体形态[24]。结核杆菌PknA和PknB也可以通过磷酸化PBPA影响结核杆菌菌体形态，但是，PknA和PknB并不是直接作用于肽聚糖的合成而影响菌体形态，而是通过影响肽聚糖的连接方式改变菌体形态[22]。MurD和GlmU受到PknA和PknB的磷酸化后也能够参与结核杆菌肽聚糖的合成，虽然MurD在结核杆菌肽聚糖合成过程中的具体作用尚不明确，但是研究发现，GlmU磷酸化后其乙酰转移酶活性明显降低[25]。结核杆菌中的HupB可被真核样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknA和PknB磷酸化，并降低与DNA的结合能力，提示PknA和PknB也可能参与细菌菌体细胞分裂过程中的DNA的分布[26]。

2.2 PASTA-eSTKs在金黄色葡萄球菌中的作用

Stk1是金黄色葡萄球菌中的eSTKs，尽管没有发现直接的证据能够说明Stk1参与了金黄色葡萄球菌细胞壁的合成，但是在某些研究发现，Stk1可能间接的参与了细菌细胞壁的合成。敲除Stk1的金黄色葡萄球菌对某些β-内酰胺类药物的敏感性增强，并且细胞形态发生改变，推测这种现象的产生可能是由于细菌细胞壁的结构发生改变而导致的[27]。同时，使用stp1基因替换金黄色葡萄球菌的Stk1之后，金黄色葡萄球菌的细胞壁变薄，进一步证实了Stk1介导的磷酸化作用在细胞壁的形成过程中发挥重要作用[28]。万古霉素和阳离子抗菌肽能够破坏细菌细胞壁而产生杀菌作用，GraSR是细菌体内与万古霉素和离子类抗生素耐药相关的二元调节系统，其中GraS发挥转移调控作用依赖于Stk1的磷酸化作用[29]。GraS中胞壁酸结合区上的3个苏氨酸在Stk1的作用下发生磷酸化后可增强对胞壁酸的结合能力，并在D-丙氨酸的调节作用下促进细胞壁的合成作用，对抗万古霉素和阳离子抗菌肽对细菌细胞壁的破坏作用[29]。

3 小结

PASTA-STKs与细菌的细胞分裂、菌体形态和耐药等密切相关，由于PASTA-STKs作用底物比较多，产生的生物学活性比较广泛，尚无关于PASTA-STKs对菌体生物学活性影响的明确机制，因此，明确PASTA-STKs对底物的特异性识别机制，对研究其在菌体内的生物学活性具有重要作用。

[1] Manning G,Plowman G D,Hunter T,et al.Evolution of protein kinase signaling from yeast to man [J].Trends Biochem Sci,2002,27(10):514-520.

[2] Standish A J,Morona R.The role of bacterial protein tyrosine phosphatases in the regulation of the biosynthesis of secreted polysaccharides [J].Antioxid Redox Signal,2014,20(14):2274-2289.

[3] Cousin C,Derouiche A,Shi L,et al.Protein-serine/threonine/tyrosine kinases in bacterial signaling andregulation [J].FEMS Microbiol Lett,2013,346(1):11-19.

[4] Dworkin J.Ser/Thr phosphorylation as a regulatory mechanism in bacteria [J].Curr Opin Microbiol,2015,24:47-52.

[5] Michard C,Doublet P.Post-translational modifcations are key players of theLegionellapneumophilainfection strategy [J].Front Microbiol,2015,6:87.

[6] Petrickova K,Petricek M.Eukaryotic-type protein kinases inStreptomycescoelicolor:variations on a common theme [J].Microbiology,2003,149:1609-1621.

[7] Jones G,Dyson P.Evolution of transmembrane protein kinases implicated in coordinating remodeling of gram-positive peptidoglycan:inside versus outside [J].J Bacteriol,2006,188(21):7470-7476.

[8] Ruggiero A,De Simone P,Smaldone G,et al.Bacterial cell division regulation by Ser/Thr kinases:a structural perspective [J].Curr Protein Pept Sci,2012,13(8):756-766.

[9] Rakette S,Donat S,Ohlsen K,et al.Structural analysis ofStaphylococcusaureusserine/threonine kinase PknB [J].PLoS One,2012,7(6):e39136.

[10] 耿 健,李绍雪,周 维,等.细菌毒力与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性 [J].动物医学进展,2014,35( 9):106-109.

[11] 杜骁杰,潘秀珍.真核样丝氨酸苏氨酸激酶在链球菌中的研究进展 [J].中国病原生物学杂志,2014,3(9):282-285.

[12] Pompeo F,Foulquier E,Serrano B,et al.Phosphorylation of the cell division protein GpsB regulates PrkC kinase activity through a negative feedback loop inBacillussubtilis[J].Mol Microbiol,2015,97(1):139-150.

[13] Mueller P,Pieters J.Identification of mycobacterial GarA as a substrate of protein kinase G fromM.tuberculosisusing a KESTREL-based proteome wide approach [J].J Microbiol Meth,2017,136 :34-39.

[14] Young T A,Delagoutte B,Endrizzi J A,et al.Structure ofMycobacteriumtuberculosisPknB supports a universal activation mechanism for Ser/Thr protein kinases [J].Nat Struct Biol,2003,10(3):168-174.

[15] 杨 旭,关东明,王胜兰,等.链霉菌真核型丝氨酸/苏氨酸激酶的研究进展 [J].微生物学报,2008,7(1):126-131.

[16] Muller C,Giambruno R,Weisser J,et al.Identifying kinase substrates via a heavy ATP kinase assay and quantitative mass spectrometry [J].Sci Rep，2016,6:28107.

[17] 康 涵,吴文娟.丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在结核分枝杆菌致病机制中的作用 [J].微生物与感染,2012,7(1):56-61.

[18] Paracuellos P,Ballandras A,Robert X,et al.The extended conformation of the 2.9-A crystal structure of the three-PASTA domain of a Ser/Thr kinase from the human pathogenStaphylococcusaureus[J].J Mol Biol，2010,404(5):847-858.

[19] 李 明,胡福泉,唐家琪.二元信号转导系统与细菌的致病性 [J].微生物学杂志,2007(1):50-54.

[20] Madec E,Laszkiewicz A,Iwanicki A,et al.Characterization of a membrane-linked Ser/Thr protein kinase inBacillussubtilis,implicated in developmental processes [J].Mol Microbiol,2002,46(2):571-586.

[21] Fleurie A,Cluzel C,Guiral S,et al.Mutational dissection of the S/T-kinase StkP reveals crucial roles in cell division ofStreptococcuspneumoniae[J].Mol Microbiol,2012,83(4):746-758.

[22] Baronian G,Ginda K,Berry L,et al.Phosphorylation ofMycobacteriumtuberculosisParB participates in regulating the ParABS chromosome segregation system [J].PLoS One,2015,10(3):e0119907.

[23] Jani C,Eoh H,Lee J J,et al.Regulation of polar peptidoglycan biosynthesis by Wag31 phosphorylation in mycobacteria [J].BMC Microbiol,2010,10:327.

[24] 高 鹏,肖春玲,姜 威,等.Ser/Thr蛋白激酶信号转导系统——抗结核药物筛选的新靶点 [J].国外医药(抗生素分册),2007,28(2):50-55.

[25] Munshi T,Gupta A,Evangelopoulos D,et al.Characterisation of ATP-dependent Mur ligases involved in the biogenesis of cell wall peptidoglycan in Mycobacterium tuberculosis [J].PLoS One,2013,8(3):e60143.

[26] Gupta M,Sajid A,Sharma K,et al.HupB,a nucleoid associated protein ofMycobacteriumtuberculosis,is modifed by serine/threonine protein kinasesinvivo[J].J Bacteriol,2014,196(14):2646-2657.

[27] Beltramini A M,Mukhopadhyay C D,Pancholi V.Modulation of cell wall structure and antimicrobial susceptibility by aStaphylococcusaureuseukaryote-like serine/threonine kinase and phosphatase [J].Infect Immun,2009,77(4):1406-1416.

[28] Hardt P,Engels I,Rausch M.The cell wall precursor lipid II acts as a molecular signal for the Ser/Thr kinase PknB ofStaphylococcusaureus[J].Int J of Med Microbiol,2017,307(1):1-10.

[29] Fridman M,Williams G D,Muzamal U,et al.Two unique phosphorylation-driven signaling pathways crosstalk inStaphylococcusaureusto modulate the cell-wall charge:Stk1/Stp1 meets GraSR [J].Biochemistry，2013,52(45):7975-7986.

ProgressonRegulatoryEffectofPASTA-eSTKonBacteria

LIN Si-tong,LIU Xiao-lin,SUN Lei,SHA Jin-dan,ZHANG De-xian,LIU Ming-chun

(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning,110866,China)

Bacteria possess a repertoire of versatile protein kinases modulating diverse aspects of their physiology by phosphorylating proteins and regulate the cell growth,virulence and drug resistance on various amino acids including histidine,cysteine,serine.eSTK is a phosphorylated protein located on the bacterial cell membrane and has an extracellular domain peculiar to the catalytic reaction zone and bacteria that are similar to the eukaryotic cells.This extracellular domain is called PASTA.In lots of recent reports suggesting that PASTA-eSTKs could be involved in the formation of compounds and life processes in bacteria including the cell wall synthesis,cell division,morphogenesis and developmental processes in spore.However,observations differ from one species to another suggesting that a general mechanism of activation of their kinase activity is unlikely and that species-specific regulation of cell division is at play.In this paper,we reviewed the regulation of eSTKs on bacterial cells by PASTA,and laid a foundation for the mechanism of protein kinase on bacterial cell division regulation and so on.

PASTA-eSTKs; protein phosphorylation; bacterial cell division; signal transformation

2017-03-30

辽宁省教育厅项目(LSNYB201601)

林思彤(1993-)，女，辽宁营口人，硕士研究生，主要从兽医药理学与毒理学研究。*

S852.2

A

1007-5038(2017)11-0094-04