甘蔗胁迫诱导表达基因ScCBF1的功能分析

成 伟, 程光远, 彭 磊, 徐 倩, 董 萌, WAQAR Ahmad, 许莉萍, 徐景升

(福建农林大学/农业部福建甘蔗生物学与遗传改良重点实验室，福建 福州 350002)

甘蔗胁迫诱导表达基因ScCBF1的功能分析

成 伟, 程光远, 彭 磊, 徐 倩, 董 萌, WAQAR Ahmad, 许莉萍, 徐景升

(福建农林大学/农业部福建甘蔗生物学与遗传改良重点实验室，福建 福州 350002)

以甘蔗苗为材料研究了甘蔗CBF1转录激活因子ScCBF1在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)以及重金属镉(CdCl2)和铜(CuCl2)胁迫下的表达情况；将ScCBF1的原核表达载体pGEX-6P-1-ScCBF1转化大肠杆菌(Escherichiacoli) Rosetta (DE3)，检测其在NaCl、PEG8000胁迫下的生长情况.结果表明:ScCBF1在MeJA、SA、CdCl2以及CuCl2逆境胁迫下表达下调；在500 mmol·L-1NaCl胁迫下，含有重组质粒的细胞生长速度显著减缓，不同浓度NaCl胁迫下的平板胁迫结果进一步说明了ScCBF1基因不具耐盐性；在15% PEG8000胁迫下，含有重组质粒细胞的生长速度明显高于对照，不同浓度PEG8000胁迫下的平板胁迫结果说明了ScCBF1基因在应答干旱胁迫中具有抗逆性.构建了ScCBF1的植物表达载体pCAMBIA1301-ScCBF1并通过农杆菌侵染在本氏烟叶片中瞬时表达，在4 ℃低温胁迫下，T0代烟草植株长势显著优于对照.

甘蔗; 转录因子; 荧光定量PCR; 胁迫; 瞬时表达

低温、干旱及高盐等非生物逆境是影响植物生长发育的主要限制因素，植物受到逆境胁迫时会产生一系列适应性调节反应以应对外界不良环境，高等植物在长期进化过程中对这些逆境形成了许多复杂的防御应答机制[1].植物应答非生物逆境胁迫的逆境胁迫调控网络非常复杂，相对下游单一功能基因，转录调控因子在应答逆境胁迫过程中往往发挥了更为重要的作用[2].通过表达转录因子基因调控下游胁迫相关基因的表达，可以提高植物的抗逆性[3-5].研究植物对非生物逆境的应答机制，提高植物的抗逆性，对于作物抗逆育种具有重要意义.

转录调控因子在植物生长发育、信号转导和功能基因的表达调控中起重要作用.CBF (C-repeat/dehydration-responsive element binding factor)是一类植物中特有的转录因子[6]，能特异性识别并与顺式元件DRE/CRT (dehydration responsive element/C-repeat)相结合，调控下游一系列干旱、高盐和低温等逆境应答基因的表达，降低或消除逆境胁迫带给植物的危害[7].研究表明，CBF在植物响应逆境胁迫调控网络中发挥着重要作用，该基因与非生物逆境胁迫(干旱、低温、高盐、ABA等)的信号传导密切相关.目前已经从拟南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、小麦(Triticumaestivum)[9]、大豆(Glycinemax)[10]、棉花(Gossypiumhirsutum)[11]、辣椒(Capsicumannuum)[12]、玉米(Zeamays)[13]和甘蔗(Saccharumofficinarum)[14]等植物中分离和鉴定出CBF基因，研究表明CBF基因受高盐、低温、干旱、ABA等非生物胁迫诱导.

甘蔗(Saccharumspp.)是世界上最主要的糖料作物和能源作物，也是重要的轻工业原料.我国甘蔗生产立地条件差，低温、干旱是限制我国甘蔗生产的主要因素.因此，挖掘甘蔗抗逆基因，解析甘蔗抗逆的分子机制，对甘蔗抗逆育种具有重要意义[15].本课题组克隆了甘蔗的CBF1基因ScCBF1 (GenBank Acc. No. KT898944)，构建了原核表达载体pGEX-6P-1-ScCBF1，在大肠杆菌中IPTG诱导GST-ScCBF1融合蛋白质的表达，并发现低温、干旱、脱落酸(ABA)胁迫可以诱导该基因的表达，高盐抑制其表达[14](已发表).本研究在此基础上，进一步分析了ScCBF1在不同逆境胁迫下的表达特性，并通过烟草瞬时表达验证了该基因对低温的抗性.

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗品种FN40和本氏烟(Nicotianabenthamiana)由本实验室提供.以甘蔗栽培品种FN40的组培苗为试验材料，促根后移至穴盘中水培，每天换水1次.待组培苗长到5片完全展开叶时，选取长势一致的幼苗在平底试管中进行外源胁迫处理.以本氏烟为受体材料进行瞬时表达试验.本氏烟种植于培养室内(温度21 ℃，光照14 h/黑暗8 h)，选取6～8周的生育期且长势一致的烟草植株进行瞬时表达试验.大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株用于生长曲线测定和平板胁迫试验；农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105菌株和植物过表达载体pCAMBIA-1301由本实验室提供.PrimeScript RT-PCR Kit反转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche)，购买自TaKaRa公司(中国，大连).限制性内切酶和T4连接酶购买自Thermo Fisher Scientific公司.

1.2 胁迫处理

对甘蔗幼苗进行激素和重金属胁迫处理，在50 mL平底试管中进行.激素处理包括水杨酸(5 mmol·L-1SA水溶液)和茉莉酸甲酯(100 μmol·L-1MeJA水溶液)，将甘蔗幼苗置于分别含有上述激素溶液的平底试管中，于0、3、12和24 h取叶片.重金属胁迫采用含有氯化镉(50 μmol·L-1CdCl2)和氯化铜(100 μmol·L-1CuCl2)的1/10 Hongland营养液胁迫处理，将甘蔗幼苗置于分别含有上述重金属溶液的平底试管中，于0、12、24和48 h取叶片[16].实验设置3个生物学重复，每个重复3株，取样后样品用液氮速冻，置-80 ℃冰箱保存备用.

1.3 总RNA提取及其cDNA第一链合成

采用TRIzol法提取甘蔗幼苗叶片总RNA.使用Nanodrop (Thermo Scientific, USA)测定RNA的浓度，按照反转录试剂盒Prime Script RT-PCR Kit使用说明书，将mRNA反转录成cDNA，作为后续实时荧光定量PCR的模板.

1.4 定量PCR检测ScCBF1在不同外源胁迫下的表达

根据克隆获得的ScCBF1基因的ORF序列，利用Primer Primer 5.0软件，设计特异性实时荧光定量PCR引物，以GAPDH基因作为内参基因[17-19](表1).按照 SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche)说明书确定定量反应体系.在7500型实时荧光定量PCR仪(ABI, USA)上完成定量PCR扩增.每个样品设置3次技术重复.扩增程序为50 ℃ 2 min；40个循环扩增(95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min).增加熔解曲线.反应结束后，采用2-ΔΔCt算法分析获得的数据[20].

表1 ScCBF1基因定量表达和瞬时表达所用引物1)

1)下划部分序列表示酶切位点.

1.5 携带ScCBF1基因的大肠杆菌细胞在不同非生物胁迫下的研究

1.5.1 生长曲线测定 进一步研究了胁迫因子NaCl、PEG对携带重组质粒(pGEX-6P-1-ScCBF1)和空载(pGEX-6P-1)的大肠杆菌Rosetta (DE3)细胞生长的影响.将活化后的菌液稀释至D600 nm=0.6，吸取2 mL的菌液加到100 mL的LB液体培养液中(分别含500 mmol·L-1NaCl，50 μg·mL-1Amp+；15% PEG8000，50 μg·mL-1Amp+)，设置3个重复，置于37 ℃，200 r·min-1的培养箱中培养，每2 h取1次样，直至取到24 h，并测定菌液D600 nm值，绘制生长曲线图.

1.5.2 斑点试验 斑点试验是将重组质粒(pGEX-6P-1-ScCBF1)和空载(pGEX-6P-1)转化到大肠杆菌Rosetta (DE3)细胞中，当其在LB液体培养基中培养至D600 nm=0.6时，将其稀释×10-3、×10-4倍，取10 μL在含有不同浓度的NaCl和PEG8000胁迫因子的LB固体培养基上(含50 μg·mL-1Amp+)点样[21-23].

1.6 ScCBF1基因表达载体的构建及农杆菌介导的烟草瞬时表达

1.6.1 pCAMBIA1301-ScCBF1重组载体的构建 以pMD19-T-ScCBF1克隆载体为模板，利用带有SalⅠ和SpeⅠ内切酶的特异性酶切位点的引物进行PCR扩增，引物序列见表1.反应体系为25 μL，含ExTaq0.125 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上下引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.375 μL.反应条件为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min.利用1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的片段，然后利用限制性内切酶SalⅠ和SpeⅠ酶切回收产物和植物表达载体pCAMBIA1301，回收的酶切产物利用T4连接酶，16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过蓝白斑筛选以及利用SalⅠ和SpeⅠ内切酶双酶切鉴定以及质粒PCR鉴定，并委托上海生物工程技术有限公司测序，最终将测序成功的重组载体命名为pCAMBIA1301-ScCBF1.

1.6.2 农杆菌介导法侵染本氏烟瞬时表达 采用液氮冻融法，将pCAMBIA1301-ScCBF1转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105感受态细胞中，将活化菌液涂在LB固体培养基(含有50 mg·mL-1Kan，35 mg·mL-1Rif)上，28 ℃培养过夜.挑取EHA105单菌落于20 mL LB液体培养基中， 28 ℃、200 r·min-1下培养过夜，使其D600 nm≈0.8；活化菌液在常温下4 000×g离心10 min后收集菌体，弃上清液，加入1 mL MS (pH 7.0)液体培养基重悬菌体；重复重悬，洗去培养基中多余的抗生素，用MS液体培养基(pH 7.0)(含200 μmol·L-1乙酰丁香酮)重悬菌体，使其D600 nm≈0.8；选择长势基本一致的本氏烟植株，光照处理1 h后，从烟草叶片背面注射(每株烟草注射3片叶片)，对照组为空载pCAMBIA-1300和未注射的烟草；注射完毕后，28 ℃下光照16 h/黑暗8 h培养.2 d后，将其放置4 ℃培养柜里，光照16 h/黑暗8 h，观察烟草表型.

2 结果与分析

2.1 ScCBF1基因在不同外源胁迫下的表达

以GAPDH为内参基因，采用荧光定量PCR方法对ScCBF1在不同外源胁迫下的表达水平进行检测.结果显示，外源SA、MeJA胁迫处理在3个时间点(3、12和24 h)抑制了甘蔗ScCBF1基因的表达，呈显著下调表达趋势，表现为SA在处理3 h的表达量达到最低，约为对照的0.7倍；MeJA在处理12和24 h的表达量达到最低，约为对照的0.3倍(图1-A).表明ScCBF1在逆境胁迫应答过程中，不通过MeJA和JA途径来介导.在CdCl2、CuCl2胁迫处理的3个时间点(12、24和48 h)，ScCBF1基因下调表达， CuCl2处理48 h的表达量达到最低，约为对照的0.3倍；CdCl2处理12 h的表达量达到最低，约为对照的0.2倍(图1-B).表明ScCBF1不具有抗重金属胁迫的能力，揭示在甘蔗的生长发育过程中，该基因在应答调控重金属胁迫过程中没有发挥作用.

A:不同外源激素胁迫下的基因表达量;B:不同重金属胁迫下的基因表达量.

2.2 生长曲线测定分析

根据取样后测定的菌液D600 nm值，绘制重组质粒pGEX-6P-1-ScCBF1与空载pGEX-6P-1在含有500 mmol·L-1NaCl和15% PEG8000的LB液体培养基中(含50 μg·mL-1Amp+)的生长曲线.结果显示(图2-A)，重组质粒的细胞生长速度在14～18 h生长最快，而空载的细胞生长速度在8～14 h最快.但随着胁迫时间的增长，重组质粒细胞生长D600 nm值要低于空载细胞生长.这个试验结果说明相对于空载，在含有NaCl胁迫介质中，抑制了重组质粒的细胞生长，进而说明ScCBF1基因在NaCl胁迫下，不具有耐盐性.此外，结果表明(图2-B)，重组质粒的细胞生长和空载的细胞生长速度都在6～8 h达到最快.但随着胁迫时间的增长，重组质粒细胞生长D600 nm值要高于空载细胞生长.这个实验结果说明相对于空载，在含有PEG8000胁迫介质中，重组质粒细胞能够对PEG胁迫有一定的抗逆性，进而揭示ScCBF1基因具有一定程度的抗旱性.

A:含有不同浓度NaCl的LB液体培养基中的生长曲线；B:含有不同浓度PEG8000的LB液体培养基中的生长曲线.

2.3 斑点试验分析

ScCBF1融合表达细胞(Rosetta+pGEX-6P-1-ScCBF1)和对照表达细胞(Rosetta+pGEX-6P-1)在含有250、500 mmol·L-1NaCl和15% PEG8000、30% PEG8000胁迫因子的LB固体培养基中(含50 μg·mL-1Amp+)点样，37 ℃过夜培养，观察LB平板上斑点的生长状态.结果表明，在不同浓度的NaCl胁迫下，重组载体的斑点生长状态劣于对照，说明ScCBF1对NaCl胁迫没有抗逆性(图3).另外，与对照相比，重组蛋白在不同浓度的PEG8000逆境下，斑点生长状态优于对照，表明ScCBF1对PEG胁迫因子有一定的抗逆性(图4).

A:空载对照(CK-pGEX-6P-1);B:融合载体对照(CK-pGEX-6P-1-ScCBF1);C:空载在250 mmol·L-1 NaCl胁迫下的表达(pGEX-6P-1);D:融合表达细胞在250 mmol·L-1 NaCl胁迫下的表达(pGEX-6P-1-ScCBF1);E:空载在500 mmol·L-1 NaCl胁迫下的表达(pGEX-6P-1);F:融合表达细胞在500 mmol·L-1 NaCl胁迫下的表达(pGEX-6P-1-ScCBF1).

A:空载对照(CK-pGEX-6P-1);B:融合载体对照(CK-pGEX-6P-1-ScCBF1);C:空载在15% PEG8000胁迫下的表达(pGEX-6P-1);D:融合表达细胞在15% PEG8000胁迫下的表达(pGEX-6P-1-ScCBF1);E:空载在30% PEG8000胁迫下的表达(pGEX-6P-1);F:融合表达细胞在30% PEG8000胁迫下的表达(pGEX-6P-1-ScCBF1).

2.4 ScCBF1基因瞬时表达分析

M1：15 000+2 000 bp marker；M2：100 bp marker；1-2:重组质粒双酶切；3-4：质粒PCR.

2.4.1ScCBF1表达载体的构建与鉴定 对构建的重组质粒用SalⅠ和SpeⅠ内切酶进行双酶切鉴定和质粒PCR验证，电泳检测后发现，酶切产物呈现清晰的两条条带，分别在600 bp(目的基因片段)和约11 000 bp(载体片段)；质粒PCR结果显示只有1条目的基因条带(600 bp).此外，重组质粒测序结果正确，表明植物表达载体构建成功(图5).

2.4.2 瞬时表达ScCBF1诱发本氏烟的防御反应 利用农杆菌介导的瞬时表达方法鉴定ScCBF1在T0代本氏烟叶片中的表达情况[24](图6).将注射过pCAMBIA-1301-ScCBF1侵染液的本氏烟放置于4 ℃恒温培养柜中观察其表型，胁迫8 h后，观察到注射pCAMBIA-1301-ScCBF1侵染液的本氏烟的叶片相比较对照组，几乎没有萎蔫；但随着本氏烟在逆境胁迫下的时间逐渐增加，在胁迫5 d后，注射pCAMBIA-1301-ScCBF1侵染液后的本氏烟和对照组萎蔫程度有所不同，但瞬时表达ScCBF1基因的烟草在长势上明显优于对照组；在胁迫15 d后，相对对照，注射pCAMBIA-1301-ScCBF1侵染液后的本氏烟顶部叶片还是较挺拔.直至叶片全部萎蔫，植株死亡.

从左至右依次是：pCAMBIA-1301-ScCBF1；pCAMBIA-1301；未注射正常植株; A：低温胁迫时间8 h；B：低温胁迫时间5 d；C：低温胁迫时间15 d.

3 讨论

低温、干旱和高盐等逆境是甘蔗生产的重要限制因素，可以造成甘蔗产量与蔗糖糖分的严重损失.近年来，细胞工程和基因工程技术开始应用于甘蔗品种的定向遗传改良，但目前仍处于研究初期阶段[25].文献表明，CBF类基因功能存在物种特异性，可以响应某种或多种胁迫[8,9,13,14].与甘蔗直系同源的玉米、高粱、水稻等作物中均已克隆到多个CBFs基因，并做了一系列的功能验证工作，这为探究该基因的功能提供了依据[13,26,27].

在逆境胁迫信号调控网络中，转录调控因子作为分子开关通过与顺式作用元件结合来调控胁迫相关基因的表达.在长期的进化过程中，植物会激发不同的防御机制来应答生物胁迫和非生物胁迫，在不同的胁迫条件下植物自身的生存能力依赖于对外界刺激的识别、产生和信号传导以及对逆境作出响应的下游抗逆功能基因的表达调控，并提高植物体内脯氨酸、甜菜碱和蔗糖等小分子有机质含量，进而维持植物细胞结构的完整性和细胞的稳定性，最终提高植物的抗逆性和适应逆境的能力[2,28,29].

前期的研究发现ScCBF1基因在转录水平上受干旱和低温非生物逆境胁迫和植物激素ABA诱导，而在NaCl胁迫下下调表达[14].本研究对ScCBF1在重金属胁迫和外源激素胁迫下的表达特性以及对携带ScCBF1基因的大肠杆菌细胞在不同非生物胁迫下的表达进行进一步探讨，结果表明，ScCBF1基因在MeJA、SA胁迫下下调表达.由此推测，甘蔗ScCBF1基因是通过依赖ABA逆境胁迫信号转导途径来参与胁迫应答过程，以确保信号分子迅速高效的传递.另外，ScCBF1基因在CdCl2和CuCl2胁迫下亦下调表达，推测该基因在应答调控重金属胁迫过程中没有发挥作用，但ScCBF1的分子机理和调控机制还有待进一步研究.生长曲线结果表明，ScCBF1不具有耐盐性，但对干旱胁迫有一定的抗逆性.进一步将重组质粒pGEX-6P-1-ScCBF1和空载pGEX-6P-1转化到大肠杆菌细胞中进行NaCl和PEG8000平板胁迫，显示在NaCl胁迫逆境下，没有表现出抗逆性，而在PEG8000逆境下，ScCBF1对PEG8000逆境有一定的抗逆性.先前的报道表明，在大肠杆菌细胞中过表达植物胁迫诱导基因会使突变细胞系在逆境下生长得更好[18,21,23,30].Gupta et al[21]研究了盐生植物盐角草DREB转录因子，结果表明该基因过表达在大肠杆菌中会对高盐、干旱和甘露醇有一定程度上的抗逆性；Guo et al[18]研究表明，甘蔗ScDir在大肠杆菌过表达对高盐和干旱显示不一样的抗逆性；Chaurasia et al[30]研究揭示鱼腥藻植物络合素合酶基因pcs在大肠杆菌过表达系统中，对高温、高盐、呋喃丹、镉、铜和紫外线等逆境胁迫有一定的抗逆作用；Su et al[23]研究表明，甘蔗过氧化氢酶基因ScCAT1过表达在大肠杆菌系统中，对高盐、CdCl2和CuCl2等逆境胁迫显示不一样的抗逆性.本研究结果与之前研究的甘蔗ScCBF1在不同非生物逆境胁迫下的表达特性是一致的[14].将构建成功植物过表达载体pCAMBIA-1301-ScCBF1，通过农杆菌介导法注射侵染烟草，在低温逆境下观察其表型.结果表明，在模式植物烟草中，低温逆境条件下，瞬时表达ScCBF1基因使转基因烟草表现出良好的抗性，为利用该基因进行遗传转化培育抗寒甘蔗品种或材料提供了生物学证据.本研究结果进一步揭示了ScCBF1在甘蔗生长发育中逆境胁迫应答中作用，为利用基因工程技术进在甘蔗抗逆育种提供了分子靶点.

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(责任编辑:吴显达)

Functional analysis ofScCBF1 in the response to stress in sugarcane

CHENG Wei, CHENG Guangyuan, PENG Lei, XU Qian, DONG Meng, WAQAR Ahmad, XU Liping, XU Jingsheng

(Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To investigate the functions ofScCBF1 in alleviating salicylic acid (SA), methyl jasmonate (MeJA), heavy metal cadmium (Cd) and copper (Cu) stress, prokaryotic expression vector pGEX-6P-1-ScCBF1 was transformed into Rosetta (DE3) strain (Escherichiacoli) in sugarcane seedlings, then the growth rate of transformed cell lines was investigated under NaCl and PEG8000 stress. The results showed thatScCBF1 was significantly down-regulated under the treatments of SA, MeJA, CdCl2or CuCl2, respectively. With 500 mmol·L-1NaCl, growth rates of cells containing the recombinant plasmid significantly slowed down. Further spot assay under different concentrations of NaCl confirmed thatScCBF1 was susceptible to NaCl. The growth of Rosetta/pGEX-6P-1-ScCBF1 cells was faster in LB liquid medium containing 15% PEG8000 compared to that of the control. Spot assay also revealed thatScCBF1 was resistant to drought stress. Moreover, the over expression vector of pCAMBIA-1301-ScCBF1 was constructed successfully and then was transformed into the leaves ofNicotianabenthamianabyAgrobacterium-mediated method. Transient expression ofScCBF1 in the tobacco plants confirmed that T0generation plants with expressedScCBF1 was more resistant to cold than the control under 4 ℃.

sugarcane; transcription factor; quantitative real-time PCR; stress; transient expression

2016-07-10

2016-09-29

国家高技术研究发展计划863计划(2013AA102604)；国家自然科学基金(31371688,31571732)；国家现代农业产业技术体系(CARS-20-1-1).

成伟(1989-)，男，博士研究生.研究方向：植物分子生物学，作物高优工程与技术.Email:qpchengwei@163.com.通讯作者徐景升(1973-)，男，副研究员.研究方向：植物分子生物学，病毒致病分子基础.Email:xujingsheng@126.com.

Q812

A

1671-5470(2017)02-0172-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.02.009