重组水蛭素肠溶胶囊单次和多次给药在Beagle犬体内的药动学研究

杨 辉，周远大，何海霞，范 开（.重庆医科大学附属第一医院药学部，重庆 40006；.重庆富进生物医药有限公司，重庆 400054）

重组水蛭素肠溶胶囊单次和多次给药在Beagle犬体内的药动学研究

杨 辉1＊，周远大1，何海霞1，范 开2（1.重庆医科大学附属第一医院药学部，重庆 400016；2.重庆富进生物医药有限公司，重庆 400054）

目的：研究重组水蛭素肠溶胶囊单次和多次给药在Beagle犬体内的药动学特征。方法：取12只Beagle犬按随机对照法分为单次ig组和单次iv组，每组6只，按0.2 mg/kg ig或iv重组水蛭素，收集血样；清洗2周后12只犬按0.2 mg/kg ig重组水蛭素，连续给药7 d，收集血样，作为多次ig组。采用酶联免疫吸附法测定血浆中重组水蛭素浓度，以DAS 2.0软件计算药动学参数。结果：单次ig和单次iv重组水蛭素在Beagle犬体内药动学特征均符合二室模型，ig重组水蛭素肠溶胶囊的绝对生物利用度为（14.908±1.868）%；单次ig组和多次ig组犬体内重组水蛭素的tpeak分别为（2.105±0.243）、（3.000±0.000）h，t1/2β分别为（8.660± 2.965）、（14.870±2.710）h，cmax分别为（10.700±0.872）、（12.05±1.587）ng/mL，AUC0-1440min分别为（55.250±4.386）、（58.978±6.002）ng·h/mL，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：ig重组水蛭素肠溶胶囊可一定程度被吸收入血；连续多天ig重组水蛭素肠溶胶囊在犬体内不产生蓄积，不改变其药动学特征。

重组水蛭素；肠溶胶囊；注射液；单次给药；多次给药；药动学；Beagle犬

水蛭（Hinudo nipponica whitman）学名为日本医蛭，是我国传统的中药材，始载于《神农本草经》，历代本草对其均有记录。药用水蛭为水蛭的干燥全体，具有破血逐瘀的作用。天然的水蛭素（Hirudin）是由65～66个氨基酸组成的多肽，是迄今为止最强的凝血酶特异性抑制剂[1-2]。由于天然水蛭素的来源匮乏，提取步骤烦琐，难以得到足够量的纯品以满足临床用药的需求。20世纪80年代末，国外应用基因工程技术，研制出与天然水蛭素结构相似、作用相同的重组水蛭素（Recombinant hirudin，rH），并在临床上得到广泛应用。重组水蛭素注射剂和脂质体鼻腔给药的药动学已有文献报道[3-5]，但重组水蛭素口服制剂的药动学研究尚未见文献报道。本研究采用酶联免疫吸附（ELISA）法，测定Beagle犬单次iv重组水蛭素注射液和单次ig、多次ig重组水蛭素肠溶胶囊后的血药浓度，研究重组水蛭素肠溶胶囊在Beagle犬体内的药动学特征，以期为水蛭素口服制剂的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

MR-250型酶标仪（天津科器高新技术公司）；B160A型医用低速离心机（河北省安新县白洋离心机厂）；BP61型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 药品

重组水蛭素肠溶胶囊[批号：030301，规格：含重组水蛭素0.25 mg/粒（抗凝血酶活力单位为3 000 ATU/粒）]和重组水蛭素注射液（批号：031101，规格：1.0 mg/mL）均由重庆富进生物制药公司提供。

1.3 动物

健康合格一级Beagle犬24只，体质量（7.0±0.8）kg，6月龄，♀♂各半，由四川养麝研究所提供，质量合格证号和环境设施合格证号分别为“川实动管第63、64号”。

2 方法

2.1 给药方案与血样采集

2.1.1 单次给药方案 参照文献[6-8]，采用随机对照设计，取12只Beagle犬，适应性喂养1周后进行实验。按随机数字表分为单次ig组和单次iv组，每组6只犬，实验前禁食12 h后，根据人用剂量换算，于次日早晨8：00分别单次ig或单次iv 0.2 mg/kg重组水蛭素肠溶胶囊或注射液。单次iv组犬分别于给药前和给药后2、5、10、20、40、60、120、240、480 min经前肢静脉取血2 mL；单次ig组犬分别于给药前和给药后60、120、180、240、360、480、840、1 440 min经前肢静脉取血2 mL。血样用3.8%枸橼酸钠抗凝，分离血浆，－20℃保存，待测。

2.1.2 多次给药方案 参照文献[9-10]，单次给药方案结束后，12只Beagle犬清洗2周后开始多次ig重组水蛭素肠溶胶囊，给药剂量为0.2 mg/kg，于每天早晨8：00时ig 1次，连续给药7 d，记为多次ig组。于每次给药前经前肢静脉取血2 mL用于测定谷浓度，分别于给药前和给药7 d后60、120、180、240、360、480、840、1 440 min经前肢静脉取血2 mL，同“2.1.1”项下方法处理后保存。

2.2 血药浓度的测定

按照笔者前期研究方法——ELISA法[11]测定各组犬各时间点重组水蛭素的血药浓度。

2.3 数据处理方法

采用DAS 2.0软件进行药动学房室模型拟合，计算药动学参数。药动学参数以±s表示，使用SPSS 19.0软件进行统计分析，两两比较采用独立样本t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 单次给药的药-时曲线

单次iv、单次ig组犬给药后体内重组水蛭素的药-时曲线见图1。结果表明，单次ig组犬体内重组水蛭素的tpeak为

图1 单次给药组犬体内重组水蛭素的药-时曲线Fig 1 Concentration-time curve in vivo of recombinant hirudin in dogs of single administration groups

（2.105±0.243）h；单次ig组和单次iv组犬体内重组水蛭素的t1/2β分别为（8.660±2.965）、（2.642±0.920）h；AUC0-1440min分别为（55.250±4.386）、（372.980±27.872）ng·h/ mL。重组水蛭素肠溶胶囊的绝对生物利用度（F）为

（14.908±1.868）%，表明重组水蛭素肠溶胶囊可在一定程度被吸收入血。

3.2 多次给药的药-时曲线

3.2.1 第1～6天谷浓度 犬给药第1～6天的重组水蛭素谷浓度均低于检测下限（0.250 ng/mL），个别可测到浓度者也未表现出累积趋势。

3.2.2 第7天血药浓度 多次ig组犬体内重组水蛭素的药-时曲线见图2。

图2 多次ig组犬体内重组水蛭素的药-时曲线Fig 2 Concentration-time curve in vivo of recombinant hirudin in dogs of multiple ig group

3.3 药动学房室模型

3种给药方式下，犬体内重组水蛭素的药动学房室模型拟合结果见表1。

由表1可知，当房室模型为二室模型，权重因子为1/C2时，其AIC最小，R2越接近1，表明Beagle犬体内药物浓度随时间的变化符合二室模型，权重系数1/C2拟合较佳。

3.4 药动学参数

单次和多次ig组犬体内重组水蛭素的药动学参数见表2。

表1 3种给药方式下犬体内重组水蛭素的药动学房室模型拟合结果Tab 1 Pharmacokinetic compartment model fitting results of dogs in vivo by 3 administration ways

表2 单次和多次ig组犬体内重组水蛭素的药动学参数（±s）Tab 2 Pharmacokinetic parameters in vivo of recombinant hirudin in dogs of single and multiple ig groups（±s）

表2 单次和多次ig组犬体内重组水蛭素的药动学参数（±s）Tab 2 Pharmacokinetic parameters in vivo of recombinant hirudin in dogs of single and multiple ig groups（±s）

参数t1/2α，h t1/2β，h K21，L/h K10，L/h K12，L/h AUC0-∞，ng·h/mL AUC0-1440min，ng·h/mL cmax，ng/mL tpeak，h CLs，L/（kg·h）单次ig组（n=6）1.399±0.146 8.660±2.965 0.249±0.189 0.217±0.046 0.128±0.070 59.489±5.780 55.250±4.386 10.700±0.872 2.105±0.243 4.042±0.533多次ig组（n=12）1.359±0.346 14.870±2.710 0.121±0.174 0.288±0.179 0.053±0.119 60.269±5.344 58.978±6.002 12.050±1.587 3.000±0.000 3.339±0.290

4 讨论

本研究前期建立了ELISA法测定Beagle犬血浆中重组水蛭素的浓度，且经验证，内源性物质不干扰重组水蛭素的测定。该方法特异性高，回收率、精密度和定量下限以及样品稀释后再测定结果均符合新药药动学的实验要求。

本实验比较了单次iv重组水蛭素注射液和单次ig重组水蛭素肠溶胶囊在犬体内的药物动学特征。结果发现，重组水蛭素无论ig还是iv，在犬体内均符合二室模型，单次ig的tpeak为（2.105±0.243）h，表明药物吸收迅速。重组水蛭素肠溶胶囊的F为（14.908±1.868）%，表明重组水蛭素肠溶胶囊可一定程度被吸收入血。本实验还比较了单次ig和多次ig重组水蛭素肠溶胶囊在犬体内的药动学特征。结果发现，单次ig和多次ig后犬体内重组水蛭素的cmax差异无统计学意义（P＞0.05）；虽多次ig后的AUC0-1440min和AUC0-∞与单次ig相比略有提高，但差异无统计学意义（P＞0.05），表明重组水蛭素肠溶胶囊每天服药1次，在体内不产生蓄积，连续服药也不会改变重组水蛭素肠溶胶囊的药动学特征。

本研究采用ELISA法测定了Beagle犬血浆中的重组水蛭素，首次报道了单次、多次口服重组水蛭素肠溶胶囊在Beagle犬体内的药动学情况，并计算获得重组水蛭素肠溶胶囊的绝对生物利用度，为重组水蛭素的临床研究提供了参考。

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（编辑：邹丽娟）

Study on the Pharmacokinetics of Recombinant Hirudin Enteric-coated Capsule by Single and Multiple Administration in Beagle Dogs

YANG Hui1，ZHOU Yuanda1，HE Haixia1，FAN Kai2（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Chongqing Fagen Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chong-qing 400054，China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetic characteristics of Recombinant hirudin enteric-coated capsule by single and multiple administration in Beagle dogs.METHODS：12 Beagle dogs were divided into single ig group and single iv group by random control method，6 in each group.Recombinant hirudin 0.2 mg/kg was intragastrically administrated or intravenously injected，blood sample was collected；after 2 weeks of cleaning，12 dogs were intragastrically administrated recombinant hirudin 0.2 mg/kg，for 7 d.Sample blood was collected，referred to multiple ig group.Recombinant hirudin concentration in plasma was determined by enzyme-linked immunosorbent assay，and pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software.RESULTS：The results showed that pharmacokinetics by ig and iv recombinant hirudin in Beagle dogs fitted to two-compartment model，absolute bioavailability of ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule was（14.908±1.868）%；the pharmacokinetic parameters in single ig group and multiple ig group were tpeakof（2.105±0.243），（3.000±0.000）h，t1/2βof（8.660±2.965），（14.870±2.710）h，cmaxof（10.700±0.872），（12.05±1.587）ng/mL，AUC0-1440minof（55.250±4.386），（58.978±6.002）ng·h/mL，without statistical significances in two groups（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule can be absorbed into the blood to a certain extent.There is no accumulation for ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule for several days，and it dose not change the pharmacokinetic characteristics.

Recombinant hirudin；Enteric-coated capsule；Injection；Single administration；Multiple administration；Pharmacokinetics；Beagle dogs

R965

A

1001-0408（2017）07-0916-03

2016-11-03

2016-12-29）

＊主管药师，博士。研究方向：新药研发、医院药学。电话：023-89012224。E-mail：yanghui_023@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.15