基于科教结合的仪器分析创新实验设计

宋红杰，邓冬艳，张立春，吕 弋

（四川大学 化学学院，四川 成都 610065）

·创新创业技术·

基于科教结合的仪器分析创新实验设计

宋红杰，邓冬艳，张立春，吕 弋

（四川大学 化学学院，四川 成都 610065）

为了贯彻四川大学关于建设一批综合性、设计型实验课程和创新探索（创业）型实验课程的教学改革指导方针，该文将科研工作与实验教学相结合，根据科研成果设计了仪器分析实验教学中一个创新实验项目——基于碳纳米点（简称“碳点”）荧光光谱法测定谷胱甘肽。该实验现象稳定、重复性好、创新性强，可作为仪器分析实验课程的教学实验。该实验涵盖了较多供学生自行探索的实验内容和研究课题，比如碳纳米点不同制备方法、碳纳米点尺寸与荧光特性关系、荧光探针设计和检测对象等，因此也可用做开放式综合化学实验教学项目。

创新实验；仪器分析实验教学；荧光光谱法；碳纳米点；谷胱甘肽

为了更好地贯彻落实《四川大学创新创业教育改革行动计划》（川大教［2016］1号），推动国家双创示范基地建设，充分利用国家级、省级实验教学示范中心和校级基础实验中心的有利条件，建设一批综合性、设计型实验课程和创新探索（创业）型实验课程，提高学生实践动手能力和创新创业能力，学校启动了四川大学实验课程教学改革项目。本文作者积极参与了该教学改革项目，将科研工作与实验教学相结合，在实验教学内容与方式改革方面做了诸多尝试；根据部分前沿性较强、具有可行性的科研成果设计了仪器分析实验教学中一个创新性教学实验项目，供仪器分析实验教学中使用，也可供开放式实验教学选用，在相关开放性实验室独立完成实验。该实验把科研工作和基础化学实验教学相结合，有利于培养学生的创新意识、探索精神和科学素养，并提高了学生实践动手能力和独立分析与解决问题的综合能力。

1 实验设计背景与意义

仪器分析实验是四川大学化学基础教学中心针对化学化工类、高分子材料类、环境类、医药类及生物类专业学生开设的一门重要的基础实验课程。目前该课程在实验内容设置上尚有不足之处，主要是缺乏综合性、设计性实验项目，实验内容中学生能够自主设计与探索的部分较少；从实验原理、实验方法、内容、步骤到问题思考与讨论，基本上是预先设定的，学生没有太多选择、发挥和自主设计实验的机会，不利于激发学生的实验兴趣、主观能动性和实践积极性，也不利于学生思维、实践和解决问题能力的提高。本文尝试将科研工作与实验教学相结合，旨在开发仪器分析实验教学中综合性、创新性实验项目［1］，探索以学生为主体、以兴趣为驱动、以问题为导向［2］的实验教学内容，将科研的思维方法和技能融入实验教学中，增加实验教学的探索性、研究性和设计性，激发学生探究实验的好奇心、学习兴趣、主观能动性和实践积极性，深化基础化学实验教学改革，提高实验教学质量，为培养高素质专业创新人才打下坚实基础。

荧光光谱分析方法是分析化学的一个重要组成部分，在临床诊断［3－4］、食品检验［5－6］、环境监测［7－8］等领域都有广泛应用，与此相关的实验项目在仪器分析实验教学大纲中有明确要求。四川大学仪器分析实验课程中基于荧光光谱法的实验教学项目“荧光法测定维生素B2片剂中核黄素含量”属于验证性实验。核黄素是传统的荧光物质，实验内容简单，需要学生思考与探索的余地较少，因此，进行实验教学内容的改革与调整对该实验课程来说势在必行。近年来，碳纳米点（CDs）作为一种新颖的碳质纳米材料，由于其优异的性质引起了广泛的关注和研究兴趣［9－11］。然而，仪器分析实验教学中几乎没有涉及该部分研究内容的实验项目。该创新实验项目将涉及较少的科学前沿融合到基础实验教学中，开拓学生视野，训练学生的科研思维，增加实验过程的探索性和挑战性，使得整个教学过程充满科学探究的乐趣。

2 实验设计

2.1 实验目的

1）了解碳纳米点的制备方法及表征技术；

2）掌握荧光分析法及荧光探针设计的原理；

3）了解荧光分光光度计的结构和工作原理。

2.2 实验原理

以富含蛋白质的鸡蛋膜为“绿色”碳源，通过水热或者高温热解的途径来合成碳点。碳纳米点在缓冲溶液中有较好的分散性和荧光特性，大约在275 nm波长的光激发下，在450 nm处呈现出较强的荧光发射峰，并且它的荧光强度可以被Cu2＋所猝灭。根据文献推测碳纳米点的荧光发射源自激子的辐射再结合［12］，而Cu2＋可以通过有效的电子转移过程来加速非辐射的电子／空穴再结合的消除，从而导致碳纳米点的荧光猝灭［13］。上述体系中再加入谷胱甘肽后，Cu2＋与谷胱甘肽分子中的巯基具有形成Cu S键的强烈结合倾向［14］，使得Cu2＋被“拉离”碳点的表面，因此，碳点的荧光就得到部分恢复。在一定条件下，碳点的荧光恢复效率与谷胱甘肽浓度存在线性关系，基于此荧光“关－开”探针系统，建立了基于碳点荧光光谱法测定谷胱甘肽的方法。

2.3 实验试剂与仪器

2.3.1 实验试剂与原料

氢氧化钠（NaOH，优级纯）购于科密欧化学试剂有限公司；硫酸铜（CuSO4，分析纯）购于金杯精细化工有限公司；胱光甘肽（GSH）、人血清蛋白、尿酸、葡萄糖购于北京莱宝生物科技有限公司；鸡蛋膜是从新鲜的鸡蛋壳上剥离下来，鸡蛋壳取自四川大学学生食堂；磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）、盐酸购于成都科龙化学试剂有限公司；实验用水来自优普超纯水系统纯化制得的超纯水（电阻率为18.24 MΩ·cm）。

磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01 mol／L）的配置：1 000mL超纯水中加入13.682 0 g的NaH2PO4·2H2O和3.298 2 g的Na2HPO4·7H2O进行溶解，在该溶液中滴加氢氧化钠或者盐酸溶液（0.1 mol／L）调节至所需的pH值。

2.3.2 实验仪器

实验仪器包括箱式电阻炉（SX－12－10，中兴伟业）、微波炉（P70D20TP－C6，Galanz）、离心机（H1850，湘仪）、紫外分光光度计（U－2910，Hitachi）、透射电镜（G2F20 S－TWIN，Tecnai）、荧光光谱仪（F－4600，Hitachi）。

2.4 实验内容

2.4.1 碳纳米点的制备

碳点是通过微波辅助加热处理“绿色”碳源（鸡蛋膜灰）制备得到的，在开放式实验教学中，学生可对不同的碳源进行探索，尝试高温高压处理其他富含蛋白质、纤维素或者糖类的有机物来制备碳点。微波辅助加热处理鸡蛋膜灰制备碳点的过程如下：所有玻璃、陶瓷器皿均使用王水（硝酸∶盐酸＝1∶3）充分浸润后，用超纯水冲洗干净后在烘箱中烘干备用。从鸡蛋壳上小心剥下新鲜的鸡蛋膜，并用大量的超纯水冲洗，除去表面附着的鸡蛋清和杂质，用陶瓷坩埚盛放鸡蛋膜，然后置于电阻炉中在400°C的条件下烘干并灼烧2 h即得到鸡蛋膜灰。在100 mL烧杯中加入30 mg鸡蛋膜灰和50 mL 1 mol／L的NaOH溶液，混匀，然后将烧杯置于微波炉中加热处理10 min即得到碳点。用大量超纯水对产物进行多次离心洗涤（离心机转速12 000 rpm），除去较大的颗粒物以及未反应完全的物质。将得到的碳点用100 mL超纯水重新分散，避光4°C保存备用。

本实验中，学生可对溶液浓度、微波功率、微波处理时间进行探索，从而获得具有不同尺寸和荧光强度的碳点，具体探索实验内容有以下3个方面。

1）在一系列100 mL烧杯中分别加入30 mg鸡蛋膜灰和50 mL不同浓度的NaOH溶液（浓度分别为0、0.1 mol／L、0.5 mol／L、1 mol／L、2 mol／L、5 mol／L和10 mol／L），混匀，然后将烧杯置于微波炉中加热处理10分钟，用超纯水对产物进行多次离心洗涤，然后用100 mL超纯水重新分散，分类标记，避光4°C保存备用。

2）在100 mL烧杯中加入30 mg鸡蛋膜灰和50 mL 1 mol／L的NaOH溶液，混匀，然后将烧杯置于微波炉中以不同的加热功率（分别采用低火、中火、中高火和高火）处理10 min，用超纯水对产物进行多次离心洗涤，然后用100 mL超纯水重新分散，分类标记，避光4°C保存备用。

3）在100 mL烧杯中加入30 mg鸡蛋膜灰和50 mL 1 mol／L的NaOH溶液，混匀，然后将烧杯置于微波炉中以中高火的加热功率处理不同时间（分别是3，5，8，10，12，15，20，30 min），用超纯水对产物进行多次离心洗涤，然后用100 mL超纯水重新分散，分类标记，避光4℃保存备用。

2.4.2 碳纳米点尺寸与光谱特性的研究

碳点尺寸的表征：将不同实验条件下制备的碳点分散液稀释后滴于铜网碳支持膜上，并置于红外灯下烘干，然后在高分辨透射电子显微镜上进行表征，得到碳点的形貌及尺寸分布信息，考察不同实验条件对制备碳点形貌及尺寸的影响。

碳点的紫外可见吸收光谱（UV－vis）特性：利用紫外可见分光光度计上对不同实验条件下制备的碳点分散液在200～600 nm波长范围内进行扫描，得到最大吸收波长，考察不同实验条件对碳点的紫外吸收特性的影响。

碳点的荧光光谱（FL）特性：在荧光分光光度计上探索不同实验条件下制备的碳点尺寸与荧光光谱、荧光强度的关系，考察激发波长变化对碳点发射光谱的影响，考察不同的制备实验条件对碳点荧光特性的影响。初步研究表明：以鸡蛋膜灰为原料直接微波加热处理制备的碳点大约分别在275 nm和450 nm显示出较强荧光激发波长和发射波长。

2.4.3 荧光光谱法测定GSH

1）基于碳点的荧光“关－开”探针的设计

在5 mL比色管中加入10μL碳点的分散液，用0.01 mol／L PBS缓冲溶液定容，在室温条件下立即在荧光分光光度计上进行荧光发射光谱扫描（激发、发射狭缝宽度设为5 nm；激发波长设置为275 nm；发射光谱扫描范围350～530 nm），记录体系荧光发射峰的强度（F0）。在5 mL比色管中依次加入10μL碳点的分散液、10μL硫酸铜溶液（Cu2＋溶液）和不同浓度的谷胱甘肽溶液，用0.01 mol／L PBS缓冲溶液定容。然后在上述仪器条件下进行荧光测定，记录混合体系荧光发射峰的强度，即为碳点恢复的荧光强度（ΔF），计算碳点的荧光恢复效率（ΔF／F0）。缓冲溶液pH值、Cu2＋浓度、仪器测试条件恒定的情况下，ΔF／F0取决于谷胱甘肽的浓度，据此可实现谷胱甘肽的测定。

2）谷胱甘肽测试条件的优化

改变实验内容1）中缓冲溶液的pH值，测定同一体系在不同pH值条件下碳点的荧光恢复效率（ΔF／F0），考察pH值对ΔF／F0的影响，确定合适的缓冲溶液pH值以用于后续荧光定量检测GSH实验。

改变实验内容1）中所加Cu2＋溶液的浓度，测定同一体系在不同猝灭剂（Cu2＋）浓度条件下碳点的荧光恢复效率（ΔF／F0），选择合适的猝灭剂浓度以用于后续荧光定量GSH检测实验。

3）绘制标准曲线

按照实验内容1）的方法配置碳点空白溶液和一系列待测标准溶液：其中缓冲溶液pH值和猝灭剂浓度按照2）中选定的结果执行，待测标准溶液中谷胱甘肽溶液的浓度从0.01μmol／L增加到200μmol／L。在相同的仪器条件下测定碳点空白溶液的荧光强度F0和加入不同浓度GSH时碳点的荧光恢复强度ΔF，计算其荧光恢复效率（ΔF／F0）。分别以ΔF／F0和GSH浓度为纵、横坐标作图，得到标准曲线、线性方程和相关系数，并计算该方法的检出限。

4）荧光探针的选择性

谷胱甘肽通过与自由基、酶的相互作用来参与生命体系的新陈代谢生理过程。生物样品中谷胱甘肽的准确测定关乎健康和疾病。因此，探针的选择性也需要进行考察。在CDs－Cu2＋－GSH体系中加入其他在生物样品中通常共存的生物小分子（例如人血清蛋白、尿酸、葡萄糖等），考察共存物对碳点的荧光恢复效率ΔF／F0的影响。

5）样品测定

按标准曲线的实验步骤，在5 mL比色管中依次加入10μL碳点的分散液、10μL硫酸铜溶液（Cu2＋溶液）和10μL经过滤、离心和稀释处理的生物样品溶液（血清或尿液），用0.01 mol／L PBS缓冲溶液定容，在相同实验条件和仪器参数下测定碳点的荧光恢复强度ΔF，计算其荧光恢复效率（ΔF／F0）。从标准曲线上查出和计算试样中GSH的含量（μmol／L）。

3 结束语

本实验教学项目首先通过“绿色”方法制备碳点对学生进行有关新型碳质材料制备与表征方面的知识与技能教学；其次根据这种新型碳纳米材料的荧光特性，又设计了荧光“关－开”探针用于检测GSH，有利于学生探索新型分析方法。该实验已在本科化学创新实验教学中顺利实施并获得好评。在教学实践中，学生参与其中进行自主设计实验内容，在探索制备方法、荧光特性与碳点尺寸的相关性和检测对象方面做了诸多尝试，激发了学生对科学研究的兴趣，增强了教学实验的趣味性，大大提高了基础化学实验教学的质量。

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Design of Innovative Instrumental Analysis Experiment Based on the Combination Scientific Research and Teaching

SONG Hongjie，DENG Dongyan，ZHANG Lichun，LV Yi
（College of Chemistry，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

In order to carry out the teaching reform guidelines of Sichuan University on the construction of a number of compre hensive，design－typed experimental courses and innovative exploration（entrepreneurial）experimental courses，scientific research were combined with experimental teaching in this paper.According to some research achievements，an innovative instrumental analysis teaching experiment——Carbon Nanodots（CDs）－based fluorescent spectrometry for detection of glutathione（GSH），was explored and designed.This experiment is stable，reproducible and innovative.It can be used as a teaching experiment of instrumental analysis experiment.Meanwhile，there aremany opening experiment contents and research topics including different preparationmethods of car bon nanodots，the correlativity between the size and fluorescence characteristic of carbon nanodots，the design of fluorescent probe，and other target analysis，therefore，the experiment can be used in opening comprehensive chemical experiment teaching project.

innovative experiment；instrumental analysis experiment teaching；fluorescent spectrometry；Carbon nanodot；Gluta thione

G642.0；O6－32

A

10.3969／j.issn.1672－4550.2017.03.004

2017－02－09；修改日期：2017－02－23

国家自然科学基金（21405107＆21505095）；四川大学实验课程教学改革项目（2016－41）。

宋红杰（1981－），女，博士，实验师，主要从事分析化学实验教学工作和基于纳米材料的发光分析方面的研究。