北方高寒地带生物堆肥中高温纤维素分解菌的筛选及分离纯化研究

张胜男　张浩洋　张跃华

摘 要：对生物堆肥中的高温纤维素分解菌进行筛选及分离纯化，探索其对纤维素的降解能力及生物学特性，研究对应的菌种特性，使其纯化利用于现代堆肥技术中以促进东北黑土地的修复，改善土壤团粒结构。采用透明圈法，筛选出此生物堆肥中的高温纤维素分解菌；纯化培养后比较其纤维素分解效率。通过筛选及分离纯化共获得有效菌种5种，分别命名为G1到G5，其中G2的滤纸失重率最高，可达70%，G1的滤纸失重率最低，为25%。生物堆肥中存在多种高温纤维素分解菌，不同菌株对纤维素类物质的分解能力具有一定的差异。

关键词：堆肥；高温纤维素分解菌；筛选；分离

中图分类号：Q89 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170331001

引言

生物堆肥是利用微生物的特性生产具有优异性能的有机肥料，是农业固体有机废弃物的有效利用重要方式[1]。堆肥秸秆中的纤维素是一种由葡萄糖组成的多糖，常温下较为稳定，是植物细胞壁的主要成分，由于其本身的结构致密且难于降解，从而阻碍了堆肥技术的发展[2]。为推进堆肥技术的进一步发展，目前，主要采用利用纤维素分解菌或其产生的酶来降解纤维素的生物手段对纤维素加以降解利用。在各种堆肥中，高温放线菌是高温条件下有机物的旺盛分解者，真菌对纤维素的分解和稳定起重要角色[3]，其在堆肥的快速腐熟中具有重要作用。相对于其它微生物类群而言，现阶段发现的高温放线菌的种类较少[4]。因此，筛选和分离纯化高效纤维素分解菌的工作凸显尤为迫切。佳木斯市地处中国东北部，属北方高寒地带。本文通过对该地区生物堆肥样品中的高温纤维素降解菌进行筛选及分离的研究，筛选出5个耐高温纤维素降解菌株，并用于降解堆肥中的纤维素成分，可促进东北黑土地的修复，对于改善土壤团粒结构，增加土壤保水、保肥的能力，改善生物堆肥中纤维素的降解效率具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌种采集

供试菌种分离于高温堆肥（作物秸秆（玉米、水稻）、马粪、牛粪等均按一定比例5：1：1混合而成，内部温度最高时可接近60℃），在此堆肥中选取带有白色菌丝的作物秸秆，置于冰箱保存。

1.2 培养基

纤维素刚果红培养基：K2HPO4 1.0g，CMC-Na 3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，（NH4）2SO4 2.0g，胰蛋白胨1.0g，刚果红0.0692g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH=7.0。

PDA培养基：马铃薯（去皮） 200.0g，葡萄糖 20.0g，

琼脂 20.0g，蒸馏水1000mL。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉浸膏5.0g，蛋白胨10g，

NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4。

高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0g，KNO3 1.0g，

K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，瓊脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4。

1.3 高温纤维素分解菌的筛选

将采集的样品置于无菌操作台中，用消毒镊子挑取白色菌丝，放入洁净培养皿中，白色菌丝接于培养基中，置于50℃左右的恒温培养箱中培养。每24h观察1次，拍照并做相应的实验记录，持续5d。观察是否有透明圈出现。若出现透明圈，则证明为有分解纤维素能力的菌株，其中透明圈的通透度和直径与该菌种的降解纤维素的效率呈正相关。

1.4 高温纤维素分解菌的分离

选取培养基中出现透明圈的菌种，将其分别接在真菌、细菌、放线菌的培养基上，置于上述温度的恒温培养箱中培养3～5d，观察菌种生长状况用镜检手段帮助判断。将菌种纯化培养并保存。

1.5 CMC酶相对活性的计算及比较

参照文献蔡燕飞等人的方法[5]，测量上述产生透明圈菌种的透明圈直径，利用公式（1）计算不同菌种CMC酶的相对活性，数值越大代表该种菌CMC酶的相对活性越高。

1.6 滤纸崩解试验

参照文献中张淑彬的方法[6]，将筛选出的菌株接种到以滤纸为唯一碳源的液体培养基中，同时做不接种的对照处理，在45℃下培养7d。进行过滤操作，将残留物在80℃下烘干称重，用公式（2）计算出滤纸失重率。

1.7 秸秆分解效果测定

参照文献蔡燕飞等方法[5]，将干秸秆切成3cm左右，将各菌株分别接种至以干秸秆为唯一碳源的液体培养基中，在转速为110r/min的摇床45℃下培养4d，将残渣滤出，80℃烘至恒重，计算降解后每克干秸秆的残重。

2 结果分析

2.1 菌种筛选结果

观察5d内纤维素刚果红培养基内透明圈产生情况，结果表明：此堆肥中主要存在5种高温纤维素分解菌使培养基产生透明圈，且产生的透明圈直径均在可测量的范围内。其它杂菌在碳源，温度均符合其生长条件的情况下也可以在此培养基中正常生长，但是不会产生具有降解特性的透明圈出现。

2.2 菌种分离结果

分离结果表明：5种高温纤维素分解菌的生长形态均不相同，若命名于G1到G5，则G1可在高氏一号培养基中正常生长，其他培养基中无明显生长现象，结合镜检结果判断其为放线菌，菌落始终为白色，无气生菌丝产生，且长势缓慢，初次观察和3d后观察到的菌落大小无明显差别，相对其他直径较小，而G2可在PDA培养基中正常生长，但其他培养基中无明显生长现象，结合镜检结果判断其为真菌，其菌丝呈丛枝状、有隔，分生孢子为浅褐色，呈现顶生或侧生，生长速率较其他快速，3d左右菌丝即可铺满整个培养皿。其他3种菌株均可在PDA培养基中正常生长（见表1）。

2.3 CMC酶相对活性的比较结果

比较结果比较表明，在培养3d的情况下，G2 的CMC酶的相对活性最高，G1的CMC酶的相对活性最低，且G2的CMC酶的相对活性约为G4的2倍（见表2）。

2.4 羧甲基纤维素钠的分解能力比较结果

滤纸条崩解试验的结果显示，G2的滤纸失重率稍高，可达70%，G1的滤纸失重率小于其他4种，约为25%；G3的滤纸失重率约为35%，G4的滤纸失重率约为40%，G5的滤纸失重率也较低，可达28%。由此表明，G2具有较强的分解羧甲基纤维素钠的能力，而G1的分解能力最弱（见表2）。

2.5 秸秆的分解能力比较结果

经过4d的培养后，G2所在的培养基内干秸秆残重最小，为0.5230.025/g，而G1所在的培养基内干秸秆残重最大，为0.8360.013/g，表明G2的纤维素分解效果较其他菌株更为理想（见表2）。

3 结论分析

实验用生物堆肥中获得5种高温纤维素分解菌，分别为G1到G5，且G2的CMC酶相对活性最高，分解纤维素的能力也相对出众；分离纯化后结合镜检结果判断G1为放线菌，而G2为真菌，其他3种菌均可在PDA培养基中正常生长，但并未判断出其具体种类。由此可以判断，纤维素分解菌广泛存在于生物堆肥中，且种类多样；微生物对来源具有差异的纤维素降解能力也不相同。从以上分析结果可见，CMC酶活力高的菌株，其滤纸分解效果也比较明显[7]；本实验所筛选得到的高温纤维素分解菌均可用于分解生物堆肥中的纤维素，将其用于农业生产中，将会大幅度提高堆肥中纤维素的利用效率，并提高土壤肥力，推动堆肥技术的发展。由于纤维素的降解速率及效果受多方面因素的影響，在实际应用中，还需在理论依据的基础上进行具体的多方面的研究。

参考文献

[1]湛方栋，何永美，陈建军，等.3种培养基分离高温纤维分解菌及其酶活测定[J].安徽农业科学，2008，36（15）：6171-6172，6232.

[2]王宝申.纤维素分解菌的分离筛选研究[J].天津农业科学，

2007，13（4）：50-52.

[3]席北斗，刘鸿亮，白庆中，等.堆肥中纤维素和木质素的生物降解研究现状[J].环境工程学报，2002，3（3）：19-23.

[4]张燕新，吴莹，张迹，等.高温放线菌分类的研究进展[J].微生物学杂志，2007，27（1）：64-68.

[5]蔡燕飞，李华兴，彭桂香，等.纤维素分解菌的筛选及鉴定[J].林产化学与工业，2005，25（2）：67-70.

[6]张淑彬，王幼珊，邹国元.不同纤维素分解菌纤维素酶活性比较试验[J].北京农业，2010，32（4）：47-49.

[7]晋昕，褚艳琴，晋小军.堆肥中高效纤维素分解菌的分离与纯化[J].中国沼气，2011，29（6）：7-11.

作者简介：张胜男（1996-）， 女， 黑龙江省大庆人， 研究方向： 环境科学； 马军（1981-）， 男， 黑龙江省哈尔滨人，博士， 助理研究员， 研究方向： 农业环境分子生态学。