自体冷血停搏液对未成熟心肌保护作用与磷酸化蛋白激酶的相关性研究

马 超，张 青，沈定荣，王元祥，彭 乐，孟保英，提运幸，丁以群

·临床研究·

自体冷血停搏液对未成熟心肌保护作用与磷酸化蛋白激酶的相关性研究

马 超，张 青，沈定荣，王元祥，彭 乐，孟保英，提运幸，丁以群

目的 探讨自体冷血停搏液对未成熟心肌保护作用与磷酸化蛋白激酶B(P－AKT)抗凋亡机制的相关性。方法

自体冷血停搏液;婴儿;未成熟心肌;先天性心脏病;蛋白激酶B/AKT

体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)心脏直视术矫治畸形是纠正先天性心脏病患儿发育异常与挽救生命的主要手段，但婴儿的心肌为未成熟心肌，与成熟心肌在组织结构、兴奋收缩耦联系统及对缺血缺氧的耐受方面较成熟心肌有差异［1］，在心内直视术中更容易受到损伤［2］。心脏停搏液灌注技术是心内直视手术中一项极其重要的对抗心肌细胞缺血后再灌注损伤的保护措施［3］，但目前并没有根据未成熟心肌的特点研究出适合的灌注液，婴儿使用的是与成年患者基本相似的心肌保护液，对婴儿的心肌保护效果不理想。为研制出适合于未成熟心肌保护的停搏液配方，本中心取自患儿自身动脉血自行制备成冷自体血心脏停搏液(cold autologous blood cardioplegia，CABC)临床应用多年，取得较好的心肌保护效果［4－5］，但至目前为止，没有对CABC与非自体冷血停搏液(NCABC)在未成熟心肌损伤中的调控作用及其机制进行深入的临床研究。PI3K/AKT信号通路具有“抗凋亡途径”之称，PAKT即为介导该途径的关键分子，本研究即通过两种不同含血停搏液的应用，观察各自对未成熟心肌保护作用与磷酸化AKT的相关性，为CABC在未成熟心肌保护应用方面提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012年10月至2015年6月在深圳市儿童医院心血管中心行CPB术的先天性心脏病患儿(年龄为12个月以下)82例，排除肝肾功能异常、肿瘤等合并症，经医院伦理委员会批准，按照是否使用CABC原则分为两组:NCABC组(A组，n=33)和CABC组(B组，n=49)，两组基本资料(见表1)。两组患儿均经气管插管行静脉复合全身麻醉，由同一组医生和CPB灌注师在中低温(25～30℃)下完成心内直视手术。

1.2 方法

1.2.1 心脏停搏液的配制方法 A组:经氧合器将预充后的氧合血与晶体按4∶1比例混合配制成含血停搏液;B组:按血液:晶体为4∶1的比例在转机前经主动脉根部快速抽取血液，保持主动脉收缩压大于等于50 mm Hg，CABC制备后经主动脉插管补充血容量以维持循环稳定，两种停搏液K+浓度均为20 mmol/L，浸入冰屑液制成4℃冷停搏液备用。

1.2.2 灌注方法 两组停搏液的灌注方法均为:升主动脉阻断后，4℃停搏液的由主动脉根部灌入，首次剂量30 ml/kg，最初保持灌注压40 mm Hg左右，快速灌注至心肌电活动静止后减慢速度，降低灌注压至30mm Hg，维持6min;间隔30min重复一次灌注，第二次剂量减半。

1.2.3 心肌取材及保存方法 分别在主动脉阻断前和主动脉开放30 min时取右心耳30 mg左右，迅速称重后将组织块平放于锡纸小盒，加OCT包埋剂浸没组织，放人盛有液氮的小杯内，20 s后组织即迅速冰结成块，置入－80℃冰箱贮存备用做冰冻切片。

1.2.4 心肌细胞凋亡情况及心肌组织P－AKT蛋白检测方法 心肌细胞凋亡情况由TUNEL法检测:切片5μm厚，割5片取一片，共取5片，严格按照说明书操作，最后在显微镜下观察，凋亡的心肌细胞呈棕褐色或棕黄色，每张切片随机选取6个高倍视野(× 400倍)，分别记录凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，以凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比作为凋亡指数(apoptotic index，AI)。AI=凋亡细胞数/心肌细胞总数×100%，每张片取平均数。

采用免疫组织化学法测定心肌组织P－AKT蛋白的含量，免疫组织化学法:切片方法同上，片厚5 μm，取5片，操作严格按照试剂说明书操作，每位患儿的切片均取一套切片不加一抗作为空白对照，最后在显微镜下观察，P－AKT蛋白大部分定位于细胞质与细胞核，阳性细胞为胞浆及胞膜内侧或细胞核呈棕黄色或棕褐色。用Image Pro Plus 6.0医学图像分析软件(Media Cybernetics，美国)分析，每张切片随机选取了5个视野，测量并计算平均光密度值，值越大，表示染色越强，阳性表达率越高，每张片取平均数。

1.2.5 心功能指标 记录或计算术中复跳时间、复跳率、术后2 h左心室Tei指数、心脏指数(CI)、左心室射血分数(LVEF)和正性肌力药物依赖情况、术后24 h心律失常发生情况等。其中复跳时间为从主动脉开放后至心脏复跳转为窦性节律的时间;以常规二维心脏超声用Simpson法测术后2 h安静状态下LVEF和CI;采用 SIEMENS Acuson Sequoia 512型超声诊断仪，探头频率6.0MHZ，Tei指数= (左心室等容收缩时间+左心室等容舒张时间/射血时间;Simpson法检测相关数据，并计算 LVEF。LVEF=(左心室舒张末容积－左心室收缩末容积/左心室舒张末容积)x 100%。每一个指标连续记录3个心动周期，取其平均值;心律失常包括阵发性室上性心动过速、频发房性早搏、Ⅱ°以上房室传导阻滞、室性早搏、室颤等。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量数据用均数士标准差(±s)表示，两组间均数采用t检验，计数数据用X2检验，相关性用Pearson相关分析，采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料 术后24 h内无死亡病例，所有患儿均成功纳入统计，两组患儿临床资料比较均无显著性差异(P＞0.05)，见表1。

2.2 两组心肌细胞凋亡情况及心肌组织P－AKT蛋白检测方法的比较 主动脉阻断前心肌组织PAKT和组织细胞AI均无显著差异(P＞0.05);主动脉开放30 min后，两组心肌组织的P－AKT和AI均显著升高(P＜0.05)，B组 P－AKT显著高于A组(P＜0.05)，B组AI显著底于A组(P＜0.05)(见图1～2及表2)。

表1 两组患者临床资料的比较

表2 两组心肌组织凋亡情况及心肌组织P－AKT蛋白的比较(±s)

表2 两组心肌组织凋亡情况及心肌组织P－AKT蛋白的比较(±s)

AI(%) P－AKT(IOD/μm2)组别主动脉阻断前 主动脉开放30 min 主动脉阻断前 主动脉开放30 min A组(n=33) 26.48±3.54 86.17±12.16 0.081±0.012 0.165±0.023 B组(n=49) 25.91±3.92 73.74±10.48 0.079±0.014 0.27±0.044 t值 0.16 5.35 1.13 13.88 P值 0.87 0.000 0.26 0.000

图1 TUNEL法检测两组心肌细胞凋亡(×400)。

图2 免疫组化法检测心肌细胞P－AKT蛋白表达(×400)。

表3 两组术中及术后心功能相关指标的比较(±s)

表3 两组术中及术后心功能相关指标的比较(±s)

例数 复跳时间(s) Tei指数 CI［L/(min·m2)］ LVEF(ms) 正性肌力药物依赖情况［n(%)］术后24 h心律失常发生率［n(%)］A组(n=33) 86.22±25.44 0.45±0.14 2.84±0.55 45.43±5.43 12(36.36) 1(3.03) B组(n=49) 69.18±19.27 0.38±0.11 3.12±0.37 52.15±7.12 13(26.53) 1(2.04) χ2/t值 2.98 2.17 2.54 5.90 0.90 0.08 P值 0.01 0.03 0.01 0.00 0.46 0.77

2.3 术中及术后心功能相关指标的比较 两组术中的复跳率均为100%，复跳时间、术后2 h左心室Tei指数、CI、LVEF、正性肌力药物依赖情况及术后24 h心律失常发生率等均有显著差异，B组显著优于A组(P＜0.05)，见表3。

2.4 相关性分析 术后心肌组织P－AKT表达量与复跳时间、AI及Tei指数负相关(r=－0.11，P=0.04; r=－0.47，P=0.00;r=－0.14，P=0.02);与LVEF及CI正相关(r=0.38，p=0.001;r=0.31，P=0.01)。

3 讨论

冷血停搏液是冷晶体停搏液与氧合血混合而成，特点是含高钾离子与镁离子，导致心肌细胞内钠离子内流速度减慢，使心肌细胞发生动作电位减慢或传播停止，心脏停跳于舒张状态。与晶体液相比，含血停搏液具有含氧、补充能量、血浆蛋白保持较高的胶体渗透压，血细胞还具有缓冲能力和抗氧自由基作用等优点［6－7］，是目前临床最常用的心肌保护液。但NCABC则需经氧合管道，与非生物材料接触后释放大量炎性因子等损伤心肌的物质，本中心取自患者自身动脉血自行制备而成冷CABC不仅避免了上述心脏停搏液的弊端，还可以使心脏停搏前出现短时间的全身器官缺血预适应［5，8－9］。经本中心初步研究［10－11］表明:CABC有利于婴儿体外循环直视手术心脏功能恢复，对未成熟心肌有良好的保护作用;对婴幼儿心肌有良好保护效果可能与降低心肌细胞氧自由基的产生有关。2010年沈定荣等［12］进一步发现:冷CABC可减轻缺血对未成熟心肌细胞线粒体的损伤，减少心肌损伤物质的释放，CABC比NCABC与HTK液能更好地保存心肌细胞能量，减轻心肌损伤，对心脏具有较好的保护作用。至目前，本中心CABC对未成熟心肌细胞凋亡影响的信号机制研究尚未开展，亦未见有相关报道。

为明确CABC对未成熟心肌细胞生存的影响机制，本研究组应用NCABC和CABC在对未成熟心肌保护作用的探讨中发现:在主动脉阻断前，两组患儿的未成熟心肌组织P－AKT蛋白的含量与心肌细胞AI均无显著差异，而在主动脉开放30 min后，两组均显著升高，且 CABC组显著高于 NCABC组。CABC组患儿心肌细胞AI显著底于NCABC组的患儿。AKT能直接磷酸化多种转录因子，通过调控这些转录因子，可以抑制凋亡基因的表达和增强抗凋亡基因的表达，从而促进细胞的存活，如，转FKHRLl、NF－kB和Bcl－2基因［13－16］，这些基因与许多细胞因子和生长因子引起的细胞分化、凋亡和生存有关; AKT还可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、Forkhead、mTOR、Par－4、P21等，从而调节细胞的增殖、分化、凋亡［17－18］，本结果表明CPB心脏直视术对心肌组织细胞具有明显的损害，造成心肌细胞凋亡，而CABC比NCABC能更好的保护心肌组织细胞，减少凋亡。在患儿心功能的检测中发现两组的复跳时间、术后2 h左心室Tei指数、CI、LVEF、正性肌力药物依赖情况及术后24 h心律失常发生率等均有显著差异，应用CABC的患儿心功能较好，表明两种心脏停搏液对心脏功能的保护具有差异，而CABC的心脏功能保护效果显著优于NCABC。相关性分析发现:心肌组织的P－AKT蛋白水平与复跳时间、心肌细胞AI、Bax/Bcl－2比值及Tei指数负相关;与LVEF及CI正相关，心脏功能受损与心肌细胞凋亡有关，心肌细胞凋亡是心脏功能恶化的因素之一［21］，此研究结果表明P－AKT蛋白表达与心肌细胞凋亡有关，CABC对心脏功能的保护作用可能通过调节P－AKT蛋白的表达，减少心肌细胞凋亡，保护心肌组织，减轻心脏功能障碍的程度。

CABC应用于未成熟心肌保护在本院虽然已经应用多年，并且取得了良好的临床应用效果，但为了更广泛的应用及其应用方法的进一步创新，其心肌保护机制需要深入的研究探讨，本文的未成熟心肌保护作用与磷酸化AKT的相关性研究是CABC与PI3K/AKT通路研究的初步结果，而CABC与PI3K/ AKT信号介导的心肌细胞保护的详细调节机制需要进一步研究探讨。

［1］ Terada Y，Tachibana K，TakeuchiM，etal.Outcome of the Pediatric Patients Who Required Repeated Cardiopulmonary Bypass during the Repair of Congenital Heart Disease［J］.Masui，2015，64(2):139－144.

［2］ 马兰，王加利，张涛，等.10公斤以下婴幼儿心脏直视术的体外循环管理［J］.中国体外循环杂，2015，13(2):105－107.

［3］ Kohlhauer M，Lidouren F，Remy－Jouet I，et al.Hypothermic Total Liquid Ventilation Is Highly Protective Through Cerebral Hemodynamic Preservation and Sepsis－Like Mitigation After Asphyxial Cardiac Arrest［J］.Crit Care Med，2015，43(10):e420－430.

［4］ 孟保英，张青，彭乐，等.含乌司他丁自体冷血心脏停搏液对婴儿心脏直视术后心肌损伤的影响［J］.中华外科杂志，2013，51(7):653－654.

［5］ 马超，沈定荣，张青，等.自体冷血停搏液对紫绀型先心病婴儿心脏的保护作用［J］.中国当代儿科杂志，2013，15(6): 453－457.

［6］ Giordano R，Arcieri L，Cantinotti M，et al.Custodiol Solution and Cold Blood Cardioplegia in Arterial Switch Operation:Retrospective Analysis in a Single Center［J］.Thorac Cardiovasc Surg，2016，64(1):53－58.

［7］ Baig MA，Sher－I－Murtaza M，Iqbal A，et al.Clinical outcomes of intermittent antegrade warm versus cold blood cardioplegia［J］.JPak Med Assoc，2015，65(6):593－596.

［8］ 徐名开，刘勇军，张小梅，等.自体冷血停搏液对心脏瓣膜置换术患者心肌损伤的影响.［J］.中国医药指南，2013，11 (21):403－404.

［9］ 张从利，李晓红，梁启胜，等.自体冷血停搏液在心脏瓣膜置换术中对心肌保护作用的研究［J］.中华全科医学，2012，10 (9):1350－1351.

［10］ 孟保英，王涛，沈定荣，等.自体冷血心脏停搏液婴儿体外循环心脏直视手术1050例［J］.中国当代医药，2010，17(19): 11－13.

［11］ 张青，孟保英，彭乐，等.自体冷血停跳液对婴幼儿心肌保护机制的研究［J］.中国当代儿科杂志，2009，11(8):638－640.

［12］ 沈定荣，王涛，张青，等.自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌细胞ATP及三磷酸腺苷酶的影响［J］.医学信息，2010，23 (7):16－17.

［13］ Zhang BG，Hu L，Zang MD，et al.Helicobacter pylori CagA induces tumor suppressor gene hypermethylation by upregulating DNMT1 via AKT－NFκB pathway in gastric cancer development［J］.Oncotarget，2016，7(9):9788－9800.

［14］ Dai F，Gao L，Zhao Y，et al.Farrerol inhibited angiogenesis through AKT/mTOR，Erk and Jak2/Stat3 signal pathway［J］.Phytomedicine，2016，23(7):686－693.

［15］ Liu Y，Cao Y，Sun S，et al.Transforming growth factor－beta1 upregulation triggers pulmonary artery smoothmuscle cell proliferation and apoptosis imbalance in ratswith hypoxic pulmonary hypertension via the PTEN/AKT pathways［J］.Int JBiochem Cell Biol，2016，77(Pt A):141－154.

［16］ Yeh YL，TingWJ，Shen CY，etal.Hypoxia Augments Increased HIF－1αand Reduced Survival Protein P－AKT in Gelsolin (GSN)－Dependent Cardiomyoblast Cell Apoptosis［J］.Cell Biochem Biophys，2016，74(2):221－228.

［17］ 陈涛，雷兰萍，周和平，等.氯通道阻滞剂对大鼠心肌缺血再灌注损伤致心肌细胞凋亡的作用［J］.中国体外循环杂志，2011，9(2):85－88.

［18］ Qu M，Shen W.Role of PI3K/AKT pathway in endoplasmic reticulum stress and apoptosis induced by saturated fatty acid in human steatotic hepatocytes［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2015，23(3):194－199.

［19］ Wang H，Bei Y，Lu Y，et al.Exercise Prevents Cardiac Injury and ImprovesMitochondrial Biogenesis in Advanced Diabetic Cardiomyopathy with PGC－1αand AKT Activation［J］.Cell Physiol Biochem，2015，35(6):2159－2168.

Research on correlation between the protection effect of cold autologous blood cardioplegia solution to immaturem yocardium and the P－AKT

Ma Chao，Zhang Qing，Shen Ding－rong，Wang Yuan－xiang，Peng Le，Meng Bao－ying，Ti Yun－xing，Ding Yi－qun
Cardiovascular Center，Shenzhen Children＇s Hospital，Shenzhen Guangdong，518026，China

Objective To explore the correlation between the protection effectof cold autologous blood cardioplegia solution to immaturemyocardium and the phosphorylated protein kinase B(P－AKT).M ethods 82 infantswith cyanotic congenital heart disease undergoing cardiac surgery were random ly divided into cold non－autologous blood cardioplegic solution(A)group(n=33)and cold autologous blood cardioplegic solution group(B)group(n=49).The right auricle tissue was taken before the aortic cross－clamping and 30 minute after the aortic cross－clamping to detectmyocardial cell apoptosis and calculate the apoptosis index(AI)with TUNEL method，and to detect the phosphorylated AKT(P－AKT)with the immunohistochemicalmethod.The auto－beating time and rate during operation，the left ventricularmyocardial performance index(Tei Index)，the cardiac Index(CI)，left ventricular ejection fraction (LVEF)，positive inotropic drug administration 2 hs postoperatively，and the incidence rate of cardiac arrhythmia 24 hs postoperatively of all patientswere recorded.Results There was no significant difference on the levels of P－AKT and AI before the aortic crossclamping between 2 groups(P＞0.05)，while all significantly elevated 30minutes after the aortic cross－clamping(P＜0.05).There were significant differences on the auto－beating time，left ventricular Tei index，CI，LVEF and positive inotropic drug administration 2 hs postoperatively，the incidence rate of cardiac arrhythmia 24 hs postoperatively between two groups(P＜0.05).The level of P－AKT in myocardial tissue was negatively correlated with AI，auto－beating time and Tei index(P＜0.05)，positively correlated with the LVEF and CI(P＜0.05).Conclusion Compared with cold non－autologous blood cardioplegic solution，cold autologous blood cardioplegic solution can promotemyocardial p－AKT protein expression，reducemyocardial cell apoptosis，and has better protective effects for immaturemyocardium.

Cold autologous blood cardioplegic solution;Infant;Congenital heart disease;Protein kinase B/AKT

2016-07-11)

2016-09-01)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.01.02

深圳市科技计划项目(201303069)

5180026广东深圳，深圳市儿童医院心血管中心

82例行体外循环术的先天性心脏病婴儿随机分为:非自体冷血停搏液(A)组33例和自体冷血停搏液(B)组49例。阻断前和主动脉开放30 min取右心耳组织，TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，计算凋亡指数(AI);免疫组织化学法测定心肌组织磷酸化AKT(P－AKT)，记录术中复跳时间、复跳率、术后2 h左心室心肌运动指数(Tei指数)、心脏指数(CI)、左心室射血分数(LVEF)和正性肌力药物依赖情况、术后24 h心律失常发生率等。结果 主动脉阻断前心肌组织P－AKT和AI均无显著差异(P＞0.05);主动脉开放30 min后，两组心肌组织的P－AKT和AI均显著升高(P＜0.05)，B组P－AKT显著高于A组(P＜0.05)，B组AI显著底于A组(P＜0.05)。两组的复跳时间、术后2 h左心室Tei指数、心脏指数(CI)、LVEF、正性肌力药物依赖情况及术后24 h心律失常发生率等均有显著差异，B组显著优于A组(P＜0.05)。心肌组织的P－AKT水平与AI、复跳时间及Tei指数负相关(P＜0.05);与LVEF及CI正相关(P＜0.05)。结论 对于未成熟心肌，自体冷血停搏液比非自体冷血停搏液能促进心肌P－AKT组织蛋白的表达，减轻心肌细胞凋亡，对心脏具有更好的保护作用。