PTH基因多态性与骨质疏松性骨折的相关性研究

王其飞，薛涛，张清华，张昆，王占国，阚金富，李冬，张光武

(北京大学首钢医院骨科，北京 100144)

实验研究

PTH基因多态性与骨质疏松性骨折的相关性研究

王其飞，薛涛，张清华，张昆，王占国，阚金富，李冬，张光武*

(北京大学首钢医院骨科，北京 100144)

目的 探讨甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)基因rs1459015位点多态性与北京地区汉族人群骨质疏松性骨折骨密度的关系。方法 研究对象为北京地区无亲缘关系的汉族人群，其中骨质疏松性骨折患者(骨折组)127例，非骨质疏松性骨折患者(对照组)145例。采用SNaPshot法检验PTH基因多态性，双能X线吸收仪测定腰椎L2～4、股骨近端的neck、Ward’s三角、troch和total骨密度，计算两组等位基因频率、基因型频率，分析骨折组和对照组各部位骨密度差异以及骨折组PTH基因多态性与各部位骨密度的关系。结果 骨折组A、G等位基因频率19.7%、80.3%，对照组A、G等位基因频率18.6%、81.4%，差异无统计学意义(P>0.05)。两组AA、AG、GG基因型频率分别为3.9%、31.5%、64.6%和3.4%、30.3%、66.2%，差异无统计学意义(P>0.05)。骨折组各部位骨密度均低于对照组，除neck骨密度差异外均有统计学意义(P<0.05)。骨折组中GG基因型腰椎骨密度均高于AA、AG基因型(P>0.05)。与AA、GG基因型相比，骨折组AG基因型髋部骨密度较高(P>0.05)。结论 PTH基因多态性rs1459015位点与北京地区汉族人群骨质疏松性骨折患者骨密度不相关。

甲状旁腺激素基因；多态性；骨质疏松；骨密度；骨折

骨质疏松症是绝经后妇女和老年人常见的全身性骨代谢疾病，主要特点是骨量降低、骨微结构破坏、骨脆性增加和骨折风险升高[1-2]。骨质疏松的发生风险主要取决于年轻时峰值骨量和之后骨量丢失率的大小[3]。通过对家系及双胞胎的研究表明，峰值骨量和骨密度与遗传因素高度相关。其中遗传因素作用在骨质疏松的发生中约占80%左右。在众多候选基因中，甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)基因是基因多态性与骨质疏松相关性研究的热点之一。甲状旁腺激素是调节机体钙、磷代谢和骨代谢的重要激素之一[4]，可以调节肠道和肾脏对钙的吸收，参与骨吸收与骨形成过程，可见血清甲状旁腺激素浓度与骨质疏松的发生密切相关。本研究探讨了PTH基因的rs1459015位点与我国北京地区汉族人群骨质疏松性骨折患者骨密度的关系，有助于我们从基因水平了解骨质疏松症的发病机制，为预防和治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 对象资料 来自2015年12月至2016年7月北京大学首钢医院住院部骨科、内分泌科和老年干部病房272例患者。骨质疏松性骨折患者127例(骨折组)，其中男39例，女88例；年龄53～96岁，平均(76.5±10.0)岁。非骨质疏松性骨折患者145例(对照组)，其中男58例，女87例；年龄50～90岁，平均(74.6±6.8)岁。该研究通过医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.1.2纳入标准 骨质疏松性骨折：女性50岁以上(自然停经3年以上)，男性60岁以上；符合骨质疏松WHO诊断标准(T2.5SD)；脆性骨折；理解本研究目的及要求，同意参与本研究并签署书面知情同意书。非骨质疏松性骨折：女性50岁以上(自然停经3年以上)，男性60岁以上；理解本研究目的及要求，同意参与本研究，并签署书面知情同意书。

1.1.3 排除标准 不能签署知情同意书；近1年使用阿仑膦酸钠或唑来膦酸等双磷酸盐类药物，近6个月使用骨化三醇、雷洛昔芬、雌激素、降钙素、活性维生素D等；近3个月进行2周以上影响骨代谢药物，如类固醇类激素等；有严重肝、肾、胃肠等重要脏器疾病；患有影响骨代谢的疾病，如有糖尿病、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、垂体疾病等；存在影响BMD测量的因素，如髋部或腰椎手术史。

1.2 方法

1.2.1 骨密度测定 骨密度测定采用双能X线吸收仪完成，测量部位包括腰椎L2～4以及股骨近端的neck、Ward’s、troch和total部位。测定过程由放射科专业技术人员协助完成。

1.2.2 标本采集 清晨空腹时采集肘静脉血2 mL于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管中，置于-80℃冰箱保存，用于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型。

1.2.3 基因组DNA提取 采用酚/氯仿法提取外周血白细胞DNA，-20℃保存。

1.2.4 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)反应 CYP11A1基因rs900798位点引物：上游引物5’-CCACTCTTGGAGCCCTTCTG-3’，下游引物5’-GAGCTGGCAATGATGTGTCC-3’。PCR反应条件：94℃(预变性)5 min，94℃(变性)30 s，59℃(退火)45 s，72℃(延伸)1 min，循环35次，72℃(再延伸)10 min。所用引物均由上海生物工程技术有限公司合成。

1.2.5 基因分型 采用SNaPshot技术，也称小测序。核心反应(即延伸反应)体系中包含：测序酶；四种荧光标记ddNTP；紧挨多态位点5’-端的不同长度延伸引物；包含SNP位点的PCR产物模板。通过反应，引物延伸一个碱基即终止，再经测序仪检测，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。

2 结 果

两组研究对象在性别、年龄和体重指数(body mass index，BMI)上差别无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(见表1)。

骨折组和对照组等位基因频率和基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡。其中骨折组A、G等位基因频率为19.7%、80.3%，对照组A、G等位基因频率为18.6%、81.4%，差异无统计学意义(P>0.05)。两组AA、AG、GG基因型频率分别为3.9%、31.5%、64.6%和3.4%、30.3%、66.2%，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

骨折组各部位骨密度均低于对照组(见表3)，除neck骨密度差异外均有统计学意义(P<0.05)。

骨折组中GG基因型腰椎骨密度均高于AA、AG基因型(P>0.05)。与AA、GG基因型相比，骨折组AG基因型髋部骨密度较高(P>0.05，见表4)。

表1 研究对象基本资料±s)

表2 骨折组和对照组等位基因频率和基因型频率分布

表3 骨折组和对照组各部位骨密度比较±s，g·cm-2)

表4 骨折组AA、AG和GG基因型与每个部位骨密度关系

3 讨 论

甲状旁腺激素编码基因位于染色体11p15[3]，该基因主要在甲状旁腺主细胞表达，其合成的甲状旁腺激素是含84个氨基酸残基的直链多肽，在人体内血浆浓度呈现清晨高午后低的昼夜波动规律，主要功能是调节钙、磷代谢及骨代谢和维持血钙、血磷浓度。PTH外周代谢器官有肾脏、肝脏和骨骼等，其中骨骼是主要的靶器官之一。PTH可激活成骨细胞，促进骨形成；也可促进破骨细胞的骨吸收作用，但骨形成作用大于骨吸收作用，故PTH能够增加骨量。相关文献报道[5]，小剂量间断注射重组人甲状旁腺激素(1-34)[recombinant human parathyroid hormone(1-34)，rhPTH(1-34)]可以提高骨质疏松症患者骨密度，降低脆性骨折风险。杨艳等[5]在一项随机对照临床研究中，将骨质疏松症患者随机分为rhPTH(1-34)组和依降钙素组，经过1年治疗后发现rhPTH(1-34)可明显改善椎体骨密度，增长速度和幅度均优于依降钙素。因此，该基因被认为骨质疏松相关的候选基因之一。

骨密度测量值是骨质疏松症的诊断金标准[6]，可用来预测骨折风险[7]。PTH基因多态性与骨密度的相关性研究在国内外有不少相关报道。Hosoi等[8]研究了383例日本绝经后妇女PTH基因BstBI位点多态性与骨密度关系，其中BB、Bb和bb型分布频率分别为82.5%、16.7%、0.8%，B、b等位基因频率为90.9%、9.1%。Bb基因型腰椎部骨密度显著低于BB基因型。Kanzawa等[9]将79例原发性甲状旁腺功能亢进患者和104例正常组作为研究对象探讨BstBI位点多态性与骨密度关系。甲状旁腺功能亢进患者BB、Bb和bb基因型频率为82.3%、15.2%和2.5%，正常组87.5%、12.5%和0%，两组基因型频率分布无差异。且甲状旁腺功能亢进患者3组基因型之间骨密度没有明显差异。

钟妮[3]的PTH基因BstBI位点多态性与女性骨密度的研究中，研究对象的BB、Bb和bb型分布频率分别为75.8%、23.3%和0.9%；等位基因频率为87.5%，12.5%；经分析绝经前后两组女性的等位基因频率和基因型频率分布，差异无统计学意义。绝经后女性的三种基因型与腰椎和股骨颈骨密度无相关性。何斌等[10]的研究中PTH基因BstBI位点BB、Bb和bb基因型分布频率分别为69.6%、27.0%、3.4%，等位基因频率为83.1%、16.9%。在协方差分析校正了年龄、体质指数等影响因素后，三种不同的基因型相互之间的腰椎、股骨颈、大转子和Ward’s三角部位骨密度均无相关性。在这两项研究中等位基因及基因型频率无明显差异，基因多态性与骨密度也不相关。但李东等[11]选择北京地区绝经后女性作为研究对象，BB、Bb和bb三种基因型的分布频率分别为64.32%、28.11%和7.56%。与BB、Bb基因型相比，bb基因型女性的前臂骨密度较低，且差异有统计学意义。这表明在不同地区、不同人群中，PTH基因型频率、等位基因频率分布不同；不同基因型之间和骨密度的关系也可能不同。

本研究中选择了一个研究较少的SNP位点PTH基因rs1459015位点。国外仅有一篇关于该位点多态性与维生素D缺乏的相关性报道[12]。尚未有关于该位点与骨质疏松患者骨密度和骨转换标志物的研究。本研究中骨折组A、G等位基因频率19.7%、80.3%，对照组A、G等位基因频率18.6%、81.4%，差异无统计学意义(P>0.05)。两组AA、AG、GG基因型频率分别为3.9%、31.5%、64.6%和3.4%、30.3%、66.2%，差异无统计学意义(P>0.05)。这与Aldaghri等[12]研究中所有受试者的A、G等位基因频率和AA、AG、GG基因型频24.6%、75.4%和6.7%、35.8%、57.5%大体一致。骨折组腰椎和股骨近端的骨密度明显低于对照组骨密度，这可能由于骨折组患者骨吸收作用明显大于骨形成作用，导致骨量丢失，骨微结构破坏，脆性增减。由于骨折组骨密度大幅度下降，故低能量损伤即可导致骨折[13]。骨折组中GG基因型腰椎骨密度均高于AA、AG基因型(P>0.05)。与AA、GG基因型相比，骨折组AG基因型的髋部骨密度较高(P>0.05)但差异不具有统计学意义(P>0.05)，需要我们进步扩大样本量、多中心研究。

本研究从基因水平上寻找骨质疏松症的发病机理，未发现PTH基因rs1459015位点多态性与北京地区汉族人群骨质疏松性骨折患者骨密度的关系，原因可能为样本量较少，缺乏多中心研究等。我们下步将扩大样本量，在不同区域、不同种族进行研究，并研究该位点多态性与骨质疏松症患者药物疗效的关系，为骨质疏松症的预防和治疗提供充分理论依据。

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作者简介：王其飞(1989- )，男，研究生在读，北京大学首钢医院骨科，100144。

Association between PTH Gene Polymorphism and Osteoporotic Fracture

Wang Qifei，Xue Tao，Zhang Qinghua，et al

(Department of Orthopedics，Peking University Shougang Hospital，Beijing 100144，China)

Objective To explore the relationship between the polymorphism of PTH gene rs1459015 and bone mineral density(BMD) of osteoporotic fracture in Han nationality in Beijing.Methods The subjects included 127 osteoporotic fracture(fracture group) and 145 non-osteoporotic fracture(control group).All subjects living in Beijing are Han Chinese without relationship.PTH gene polymorphisms were identified by SNaPshot.BMDs of the lumbar spine (L2～4) and proximal femur including neck，Ward’s，triangle troch and total hip were measured by dual energy X-ray absorptiometry.Allele frequency and genotype frequency were calculated.The BMD difference of two groups and the relationship of the PTH gene polymorphism with BMD of each location in fracture group were analyzed.Results The A and G allele frequency in two groups were 19.7%，80.3% and 18.6%，81.4%，without statistical significance(P>0.05).AA、AG、GG genotype frequencies of two populations were 3.9%，31.5%，64.6% and 3.4%，30.3%，66.2%，and this difference was not statistically significant(P>0.05).The BMDs of each location in fracture group were lower than those in control group，and the differences were statistically significant(P<0.05)，not including the difference of BMD of neck.The BMDs of GG genotype were higher than those of AA and AG genotype in fracture group (P>0.05).Compared with AA and GG genotypes in fracture group，AG genotype had higher BMD of hip.Conclusion The PTH gene polymorphism is not associated with BMD of osteoporotic fracture.

parathyroid hormone gene；polymorphism ；osteoporosis；bone mineral density；fracture

韩健(1966- )，男，主任医师，兰州大学第二临床医学院骨科，730030。

1008-5572(2017)03-0240-04

北京市科技计划项目(Z131100002613002)；*本文通讯作者：张光武

R580

A

2016-09-30

王其飞，薛涛，张清华，等.PTH基因多态性与骨质疏松性骨折的相关性研究[J].实用骨科杂志，2017，23(3)：240-243.