微小RNA-124在急性脊柱创伤所致急性脊髓损伤中的诊断价值

陈聚伍，谢 冕，任 佳，孟 宇

·临床诊疗提示·

微小RNA-124在急性脊柱创伤所致急性脊髓损伤中的诊断价值

陈聚伍*，谢 冕，任 佳，孟 宇

目的 探讨微小RNA-124(miR-124)对急性脊柱创伤所致急性脊髓损伤的诊断价值。方法 选取2014年9月—2015年9月在郑州大学第一附属医院急诊入院的45例急性脊柱创伤患者，并按照脊髓损伤神经学分类国际标准中的美国脊髓损伤协会残损分级(AISA分级)将患者分为脊髓完全损伤组(AISA分级A级)15例、脊髓不完全损伤组(AISA分级B、C、D级)15例、神经功能正常组(AISA分级E级)15例，另选取同期入院的急性四肢创伤患者15例为对照组。抽取各组患者创伤后24 h内外周静脉血并对其血浆miR-124水平及血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平进行测定。结果 各组间miR-124、TNF-α水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊髓完全损伤组、脊髓不完全损伤组的miR-124、TNF-α水平均高于神经功能正常组与对照组(P<0.05)。患者创伤后24 h外周静脉血miR-124、TNF-α诊断急性脊髓损伤的受试者工作特征(ROC)曲线下面积分别为0.948〔95%CI(0.890，1.000)〕、0.770〔95%CI(0.641，0.879)〕。结论 miR-124诊断急性脊髓损伤的特异度要优于TNF-α，今后可将miR-124作为诊断急性脊柱创伤后急性脊髓损伤的潜在检测标志物。

脊柱损伤；脊髓损伤；诊断；肿瘤坏死因子-α；微小RNA-124

陈聚伍，谢 冕，任 佳，等.微小RNA-124在急性脊柱创伤所致急性脊髓损伤中的诊断价值[J].中国全科医学，2017，20(12)：1506-1510.[www.chinagp.net]

CHEN J W,XIE M,REN J，et al.Diagnostic value of miR-124 in acute spinal cord injury caused by acute spinal trauma[J].Chinese General Practice，2017，20(12)：1506-1510.

急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种由高能量损伤引起的病死率高、并发症多、致残率高、预后差的疾病[1]。患者多伴有终身躯体功能障碍，给社会及其家庭带来极大负担和痛苦[2]。随着经济发展，由车祸伤、坠落伤引起的急性SCI的救治，日益成为创伤外科面临的难题。

微小RNA(miR)是一类由21～25个核苷酸组成的内源性表达的单链非编码小RNA,通过抑制靶mRNA翻译或促使其降解对基因表达起调控作用[3]。微小RNA-124(miR-124)在中枢神经系统中表达水平特异性升高，但在其他组织中尚未发现这种特性[4]。近年来，通过外周静脉血标志物监测中枢神经的早期病变或预测重度中枢神经病变的预后受到更多研究者的重视[5-6]。有研究显示，神经组织及外周静脉血肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平与脊髓损伤相关[7]。动物研究证实当中枢神经受损时，外周静脉血中的miR-124水平会发生变化[8]。本研究旨在探讨miR-124对急性脊柱创伤所致急性SCI的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 纳入标准及排除标准 纳入标准：(1)急性SCI患者符合2013美国神经外科医师大会(CNS)和美国神经外科医师协会(AANS)发布的急性脊髓损伤管理指南中的相关诊断标准[9]，急性四肢创伤患者有明确的影像学诊断；(2)患者创伤发生时间距入院时间均在24 h内；(3)患者年龄≥18周岁。排除标准：(1)半年内有脊髓及颅脑相关创伤及手术史者；(2)存在大面积心肌梗死或急性冠脉综合征、严重心律失常、急性呼吸窘迫综合征等严重心肺疾病者；(3)急性严重颅脑损伤(严重脑创伤、大量脑出血、大面积脑梗死、严重脑干损伤等)者；(4)孕妇；(5)既往有急性SCI、颅脑损伤史者；(6)伴有恶性肿瘤、急慢性感染、严重肝肾功能不全、脑血管疾病、自身免疫性疾病及血液系统疾病者。

1.2 研究对象 回顾性分析2014年9月—2015年9月在郑州大学第一附属医院急诊入院且诊断明确的急性脊柱创伤患者的临床资料。最终确定符合纳入标准且资料完整的急性SCI患者共45例，其中颈椎骨折27例、截瘫26例、四肢瘫痪19例、胸腰椎骨折18例。按照SCI神经学分类国际标准中的美国脊髓损伤协会残损分级(AISA分级)[10]将患者分为脊髓完全损伤组(AISA分级A级)15例、脊髓不完全损伤组(AISA分级B、C、D级)15例、神经功能正常组(AISA分级E级)15例；另选取同期入院的急性四肢创伤患者15例为对照组。本研究经本院伦理委员会审查通过，符合医学伦理学标准，并获得患者或其代理人同意。

1.3 主要试剂及仪器 TNF-α放射免疫检测试剂盒：北京北雅免疫生物技术研究所；RNA提取试剂：美国MRC公司-TRI Reagent BD；实时灾光定量PCR试剂盒及反转录试剂盒：TaKaRa公司；γ计数器：德国PerkinElmer公司；PCR仪：美国ABI公司；ND2000C紫外分光光度计：美国赛默飞世尔科

本文创新点/不足：

(1)既往的脊髓损伤动物模型多测定脊髓组织中微小RNA-124(miR-124)水平的远期改变，很少关注急性期改变，无论是在相关动物实验还是临床研究中，均少有涉及。(2)本研究的观察对象相对较少，入组患者创伤的类型并不十分全面，与急性脊柱创伤的疾病谱有一定差异，这和创伤性疾病的分级救治与转运规律有一定关系。

技公司。

1.4 标本采集 患者入院后(创伤发生后24 h内)采集外周静脉血约4 ml，置于EDTA-K2抗凝管，在4 ℃条件下保存。

1.5 血浆miR-124水平测定 采用实时荧光定量PCR技术测定血浆miR-124水平，外周静脉血标本在3 000×g条件下离心10 min，取得血浆并转至1.5 ml EP管中，在12 000×g条件下再次离心10 min后取200 μl血浆，用RNA提取试剂提取总RNA。ND2000C 紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。取A260/A280为1.8～2.1 的样品用于下一步实验；严格按反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。由广州市锐博生物科技有限公司完成引物的设计与合成。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性3 s，60 ℃退火、延伸30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，1个循环绘制溶解曲线。内参基因：U6。血浆miR-124水平用2-ΔΔCt法计算[11]。

1.6 血清 TNF-α水平测定 采用放射免疫法测定血清TNF-α水平，严格按试剂盒说明操作。

2 结果

2.1 各组一般资料比较 各组性别、年龄、身高、体质量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；各组入院体温比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 各组外周静脉血miR-124、TNF-α水平比较 各组miR-124、TNF-α水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊髓完全损伤组、脊髓不完全损伤组miR-124、TNF-α水平均高于神经功能正常组与对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3 外周静脉血miR-124与TNF-α对急性SCI的诊断价值 外周静脉血miR-124与TNF-α诊断急性SCI的AUC分别为0.948〔95%CI(0.890，1.000)〕及0.770〔95%CI(0.641，0.879)，见表3、图1〕。

表1 各组一般资料比较

Table 1 General data of complete SCI,incomplete SCI,normal nerve function and control groups

组别例数性别(男/女)年龄(x±s,岁)身高(x±s,m)体质量(x±s,kg)入院体温(x±s,℃)对照组159/643.5±10.51.7±0.164.3±7.336.8±0.4脊髓完全损伤组159/645.9±10.81.7±0.162.8±9.437.6±0.8脊髓不完全损伤组1510/544.5±10.61.7±0.163.6±9.237.4±0.5神经功能正常组1510/547.1±11.61.7±0.164.5±6.837.2±0.6F(χ2)值0.29a0.31-0.200.135.07P值0.960.820.890.94<0.05

注：a为χ2值

Table 2 miR-124 and TNF-α levels in peripheral venous blood in complete SCI,incomplete SCI,normal nerve function and control groups

组别例数miR-124TNF-α(μg/L)对照组150.34±0.041.69±0.19脊髓完全损伤组150.48±0.06a1.97±0.22a脊髓不完全损伤组150.47±0.07a1.85±0.43a神经功能正常组150.39±0.07bc1.78±0.21bcF值27.283.51P值<0.01<0.05

注：miR-124=微小RNA-124，TNF-α=肿瘤坏死因子α；与对照组比较，aP<0.05； 与脊髓完全损伤组比较，bP<0.05；与脊髓不完全损伤组比较，cP<0.05

表3 外周静脉血miR-124、TNF-α对急性SCI的诊断价值

Table 3 Value of miR-124 and TNF-α in peripheral venous blood for the diagnosis of acute SCI

指标截断值灵敏度(%)特异度(%)约登指数阳性预测值(%)阴性预测值(%)miR-1240.459a90.090.00.80090.090.0TNF-α1.82576.780.00.56779.377.4

注：a为相对表达水平

3 讨论

急性SCI作为患者长期预后及生存质量最差的骨科急症之一[12]，极易造成家庭巨大的医疗支出。判断急性脊柱创伤是否伴发急性SCI主要通过病史的采集和相关体格检查，精神状态较好的成年患者可以告知医师主诉并且配合其完成体格检查，但是由于疼痛、惊吓、休克等原因造成不能早期判断患者SCI情况[13]。一旦发生急性SCI，易引起神经组织内链式的炎性反应，伴随有大量炎性细胞与炎性递质的渗出及浸润，再加之骨折端的物理刺激、血肿压迫等原因导致患者病情在早期常会出现进行性加重，损伤发生超过24 h，再行手术和药物治疗将丧失最佳治疗时机[14]。临床上也使用体感诱发电位和MRI获取患者急性SCI的客观信息，但面临躯体多次搬运、设备及人员的完备率、脱离高级生命支持状态下时间过长、患者本人主客观条件不配合(如疼痛、创伤后精神障碍)等诸多难以解决的问题。而此时实验室诊断则排除了上述主客观因素的干扰，在避免漏诊、缩短确诊时间、治疗方案的制定和手术时机的把握等方面体现出较大辅助作用。外周静脉血是临床上最常用的标本类型，以往的研究中多使用外周静脉血中前列腺素等炎性因子，核因子κB(NF-κB)等细胞转导通路的标志物，半胱氨酸蛋白酶32等调控蛋白作为急性SCI的相关判定指标[15-17]。TNF-α最早是作为一种具有杀伤肿瘤作用的物质被发现，已有研究认为TNF-α在中枢神经组织的损伤中具有指示作用[18]，也有研究者对白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)在急性SCI诊断方面进行了研究[19]，但是这些指标在炎性疾病、肿瘤性疾病中均有特征性表现，单纯通过病史并不能确定患者体内的相关因子变化有单一的中枢神经损伤来源。miR-124是最早被证实在成年哺乳动物的脑和脊髓神经元中大量表达的miR分子之一，近年来其在中枢神经损伤方面的临床研究逐渐深入。以往学者发现miR-124在脑缺血、癫痫、帕金森病等中枢神经系统疾病发生中起着较为重要的作用[20-22]。近年来不断有实验证实miR-124在小鼠等哺乳动物急性SCI后的继发性神经损伤过程中有十分重要的作用[23]，并且其在急性SCI的干细胞治疗领域的靶向指导作用也受到重视[24]，给急性SCI组织的修复与再生研究提供了重要的靶点和监测指标[25]。

注：miR-124=微小RNA-124，TNF-α=肿瘤坏死因子α

图1 外周静脉血miR-124与TNF-α诊断急性SCI的ROC曲线

Figure 1 ROC curve for miR-124 and TNF-α in peripheral venous blood for the diagnosis of acute SCI

本研究结果显示，脊髓完全、不完全损伤组患者创伤后24 h内外周静脉血miR-124、TNF-α水平均高于神经功能正常组与对照组，说明上述两指标对于急性脊柱创伤患者急性SCI的诊断均有指导意义，其中miR-124诊断急性SCI的特异度(90.0%)和灵敏度(90.0%)均高于TNF-α(特异度80.0%，灵敏度76.7%)。患者伤后24 h内外周静脉血miR-124诊断急性SCI的AUC(0.948)大于TNF-α(0.770)，miR-124相较于TNF-α更适合协助诊断急性SCI。将来在面对有疑似急性脊柱创伤病史的患者时，医生在24 h内抽取外周静脉血，测定miR-124水平，就能筛选出急性SCI患者，进而进行积极手术/药物治疗，以改善预后、减少致残的发生。

综上所述，miR-124诊断急性SCI的特异度明显优于TNF-α，能够在创伤发生的急性期(24 h内)鉴别出急性SCI患者，有利于急性SCI急诊手术的开展。未来可将miR-124作为诊断急性脊柱创伤后急性SCI的潜在检测标志物。

作者贡献：陈聚伍负责试验设计，撰写论文并对文章负责；谢冕负责课题实施，试验数据、资料收集，统计分析，文章审校；任佳、孟宇负责标本采集和临床资料整理。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔莎)

Diagnostic Value of miR-124 in Acute Spinal Cord Injury Caused by Acute Spinal Trauma

CHENJu-wu*,XIEMian,RENJia，MENGYu

EmergencyMedicineDepartment,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

*Correspondingauthor:CHENJu-wu,Professor;E-mail:feiyangdabeiyao@yahoo.com

Objective To investigate the diagnostic value of microRNA-124(miR-124) in acute spinal cord injury(SCI) caused by acute spinal trauma.Methods The subjects enrolled in this study were 45 patients with acute spinal trauma and 15 patients with acute limb trauma admitted to Emergency Medicine Department of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University from September 2014 to September 2015.In accordance with the SCI level evaluated by American Spinal Injury Association(ASIA) Impairment Scale in International Standards for Neurological Classification of Spinal Cord Injury,the patients with acute spinal trauma were divided into complete SCI group(ASIA grade A,n=15) and incomplete SCI group(ASIA grade B,C,D,n=15),normal nerve function group(ASIA grade E,n=15).The patients with acute limb fracture were set as the control group.Peripheral venous blood was taken from the patients in each group within 24 hours after injury and the levels of plasma miR-124 and serum tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) were measured.Results Significant differences in miR-124 as well as in TNF-α levels were found between the groups(P<0.05).Levels of both miR-124 and TNF-α were higher in the complete SCI group than in normal nerve function group and control group(P<0.05).Incomplete SCI group had higher levels of both miR-124 and TNF-α than the normal nerve function group and control group(P<0.05).The area under the curve(AUC) of receiver operating characteristic(ROC) of miR-124,TNF-α at 24h after injury for diagnosing acute SCI was 0.948〔95%CI(0.890，1.000)〕,0.770〔95%CI(0.641，0.879)〕 respectively.Conclusion The specificity of miR-124 for the diagnosis of acute SCI due to spinal trauma is better than that of TNF-α.Therefore,in the future,miR-124 can be used as a potential marker for the diagnosis of the disease.

Spinal injuries;Spinal cord injuries;Diagnosis;Tumor necrosis factor-alpha;miR-124

国家临床重点专科建设项目(2012-649)

R 826.64

B

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.12.019

2016-11-19；

2017-02-08)

450052河南省郑州市，郑州大学第一附属医院急诊医学部

*通信作者：陈聚伍，教授；E-mail:feiyangdabeiyao@yahoo.com