叠氮溴化乙锭与PCR技术结合检测活菌研究进展

吕嫱，姜兆兴，王海艳，赵林立，曹旭，崔强，赵治国，*，郭铁筝，刘来俊

（1.内蒙古出入境检验检疫局检验检疫技术中心，内蒙古呼和浩特010020；2.赤峰出入境检验检疫局，内蒙古赤峰024000）

叠氮溴化乙锭与PCR技术结合检测活菌研究进展

吕嫱1，姜兆兴2，王海艳1，赵林立1，曹旭2，崔强1，赵治国1，*，郭铁筝1，刘来俊1

（1.内蒙古出入境检验检疫局检验检疫技术中心，内蒙古呼和浩特010020；2.赤峰出入境检验检疫局，内蒙古赤峰024000）

微生物检验是食品安全把关的重要环节，而应用传统的培养法检测微生物难以做到及时、准确。PCR技术的出现为微生物快速检测开辟了新的途径，但该方法又难以区分食品中的死活菌。叠氮溴化乙锭（Ethidium monoazide bromide，EMA）与PCR技术相结合，可以快速、准确检测食品中活体微生物，有效减少食品安全事件的发生。将对近年来EMA与PCR、RT-PCR和LAMP技术结合用于食品中活菌研究进展做一综述。

叠氮溴化乙锭；PCR技术；活菌

一直以来，食品安全问题都是世界性焦点，食品检测是保障人类生命安全与生活质量的基础性工程。我国食品安全事件频发，严重影响了人民群众的身心健康和国民经济的良性发展。其中，食源性致病菌微生物危害尤为突出，现有检测方法采用常规培养法检测，该方法是多数微生物检测的通用方法，但也有许多难以克服的弊端，一是检测灵敏度低，若食品中杂菌多目标菌较少，容易发生漏检；二是各种菌在平板上形态各异，检测人员需要有一定经验才能准确判定[1]；三是该方法检测周期较长，甚至检测结果出具时食品已过保质期或已被消费者广泛食用。另外，在我们的检测工作过程中发现，由于食品在加工、运输和储藏中环境等因素的变化，细菌容易存活于活的非可培养（Viable but non-culturable，VBNC）状态，它是细菌的一种特殊存活机制，是对不良环境的适应性反应[2-3]，由于VBNC菌不可培养的性质，急需寻找能替代传统平板计数法的方法[4]。

近年来，人们尝试各种基于核酸扩增的检测方法如普通PCR、荧光定量PCR和LAMP检测样品中的致病菌，但由于食品样品DNA在死菌中能保留较长时间，传统的核酸检测法并不能区分死活菌。鉴于mRNA的半衰期较短，一般只存在于活体细胞中，是活菌检测的新路径。然而mRNA易受食品基质中各种成分如脂肪、血细胞和蛋白质的影响而不易被提取，从而使检测灵敏度降低。叠氮溴化乙锭（Ethidium monoazide bromide，EMA）的发明为基于DNA检测活菌开辟了新的思路，它在光激活作用下能与死细胞基因组DNA结合并抑制其进行PCR扩增，而由于完整未受损伤的活菌细胞膜能够阻止EMA的渗透，对活菌DNA则不起作用。目前，将EMA与普通PCR、荧光定量PCR、LAMP等技术结合用于食品中活菌检测已成为研究热点。

1 EMA简介

叠氮溴化乙锭（Ethidium monoazide bromide，EMA）是Hixon等[5]发现于上世纪70年代的核酸荧光染料，分子式为C21H18BrN5，分子量为420，不溶于水、可溶于乙醇的橙色固体。其特点是当样品中死活细胞共同存在时，能选择性地与死细胞DNA共价结合[6]。其主要原理是：通常死细胞的细胞膜已经遭到破坏，EMA很容易渗透到细胞内部从而插入到细胞内DNA双螺旋上。但活菌的细胞膜比较完整，EMA不能渗透到活菌内部。后续经过高强度的可见光曝光处理后，插入到DNA双螺旋上的EMA能够与DNA双螺旋发生共价交叉偶合，且这种共价偶合具有不可逆性，从而抑制后续PCR扩增中引物与死菌DNA的结合，达到区分死活菌的目的[7]。

以EMA-PCR为例说明：将EMA加入到含有活菌和死菌的测试样品中，曝光1min导致游离EMA穿透死亡细胞并与DNA共价结合，但不能进入活细胞。与EMA共价结合的死细胞DNA和未与EMA结合的活细胞DNA，在PCR反应中，来自活细胞的DNA是可以与引物结合进行PCR扩增，而死细胞DNA由于与EMA的不可逆结合不能被扩增[8]。

2 EMA在区分死活菌中的应用

2.1 EMA与PCR技术

1985年，Randal等[9]首次在science发表聚合酶链式反应（Polymerase chain reactiom，PCR），它是一种体外核酸序列扩增技术。PCR是在模板DNA、四种脱氧核糖核苷酸和引物存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应，经过双链DNA的高温变性、引物与模板的低温退火和适温延伸3个步聚反复循环，PCR的特定DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，达到迅速大量扩增目的[10]。PCR技术已在分子生物学、法学、医学、生物化学等领域得到了广泛应用。

将EMA与PCR技术联用可以克服传统PCR无法区分死活菌的缺点[11]。目前EMA-PCR方法已用于多种致病菌的检测。2005年，Knut等[8]在检测经过灭菌和抗生素处理的复杂食品中难以培养的细菌时，EMA-PCR法起到了良好的效果。2006年，Jung-Lim等[12]利用EMA处理鳕鱼片肉汤培养物的细菌混合菌群后，用通用引物DG74和RW01扩增所有真细菌16S rDNA的高度保守区的序列片段（约370 bp），结果较为理想。2010年，Minami等[13]通过小剂量的EMA处理，检测婴儿配方食品中活的阪崎肠杆菌。2013年，Saiyudthong等[14]研究鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）和肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）时，将鸡肉样品在营养肉汤中预培养，微生物得到大量繁殖后，再利用EMA-PCR法进行检测，使检测结果更加可靠。2015年，Hiroaki等[15]采用EMA-PCR方法分析来自6个冷却塔和3个洗浴水样的军团菌属多样性，针对将617个16S rRNA基因序列分为99个操作分类单位（OTUs），且与VBNC状态培养的细菌具有差异性。大量研究证实，EMA确实能穿过死细菌不完整的细胞膜与基因组DNA结合，“屏蔽”死细胞和游离状态的DNA，使其不能作为模板进行PCR扩增。

2.2 EMA与荧光定量PCR技术

1996年，Applied Biosystems公司首次推出荧光定量 PCR技术（Real Time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）。荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测整个PCR扩增过程中荧光信号的积累，最后通过已知浓度的标准样品制作的标准曲线，对未知浓度样品进行定量分析的技术。该方法弥补了传统PCR技术不能定量的不足，具有特异性好、定量准确、灵敏度高、自动化程度高和速度快等优点，并且实现了PCR从定性到定量的飞跃[16]。

近年来，关于EMA与实时RT-PCR相结合定量检测食品中致病菌活细胞的研究报道比较多。2005年，Rudi等[17]采用EMA与荧光定量PCR法结合用于检测活、死的和VBNC状态下的荷兰产高德干酪（gouda-like cheeses）中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。2009 年，Helen 等[18]采用相同的方法检测果汁发酵过程中败坏酵母（Zygosaccharomyces bailii）的产生过程。同年，Wang[19]分别用EMA与荧光定量PCR结合法、反转录RNA扩增法和荧光定量PCR法对禽肉和牛肉制品中大肠杆菌O157：H7和沙门氏菌进行检测，结果表明EMA与荧光定量PCR结合法检测效率最好。2010年，Wang等[20]采用EMA与荧光定量PCR结合法检测鸡肉和鸡蛋培养液中沙门氏菌，检测低限可达10 CFU/mL。Meng[21]分别用EMA与荧光定量PCR结合法和平板计数法定量检测双歧杆菌，结果表明两种方法检测结果有良好的相关性（R2=0.994 8），EMA与荧光定量PCR结合法可直接、快速（4 h内）完成商业酸奶中活的双歧杆菌检测。2012年，Soejima等[22]采用EMA与荧光定量PCR结合法，扩增较长片段16S-23S rRNA基因序列（2 451 bp），分析巴氏杀菌乳总大肠菌群。Shi等[23]采用玻璃珠DNA提取方法和EMA与荧光定量PCR结合法检测葡萄酒中微生物，如酵母、酿酒酵母、乳酸菌（LAB）、乙酸菌（AAB）和非酒花（oeniLAB）的测定。2014年，Seinige等[24]将EMA与荧光定量PCR结合法成功应用于水样中弯曲杆菌的分离与鉴定，结果表明该法对死活菌混合物的检测优于荧光定量PCR法。

2.3 EMA与LAMP技术

2000年，Notomi等[25]首次提出环介导等温扩增技术 （loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP），它是针对靶基因6个区域设计4条LAMP特异性引物，利用DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）在恒温条件下保温约60 min进行扩增。目前，已有EMA-LAMP技术成功用于食源性病原菌检测的报道。2009年，Lu等[26]采用EMA-LAMP分析沙门氏菌的invA基因序列。2012年，Wang等[27]采用相同的方法扩增tlh基因检测VBNC状态下的副溶血性弧菌，来自死菌的DNA扩增被EMA成功抑制，而处于VBNC状态下菌株被成功扩增出来。2015年，Wu等[28]采用EMA与Real Time-LAMP结合的方法研究食源性致病菌肠炎沙门氏菌，并通过不断试验优化选择了最佳的EMA浓度。

综上所述，EMA与分子生物学方法结合在生命科学的各个领域应用前景广阔，但也有一些弊端，研究学者Kobayashi等[29]采用EMA与荧光定量PCR结合法分析葡萄球菌属的tuf基因，表明EMA并不是可以将所有死活菌可靠区分，如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，可能原因是该细菌细胞壁较厚。研究表明，一定浓度的表面活性剂在较低浓度下能显著改变细菌的表面性质，具有增加细胞膜通透性的能力[30]，可以有效补充该方法对个别细菌死活菌难以区分的弊端。另外，反复冻融也可以使细菌细胞膜破裂，Lee等[31]扩增来自鳕鱼块细菌16S rDNA保守区域的序列，表明反复冻融破碎法导致细胞膜的损伤，通过共聚焦显微镜显示EMA更容易穿透到细菌中。同时，使用其他的核酸插入活力染料叠氮溴化丙锭（PMA），将EMA和PMA在应用分子生物学检测技术前进行预处理[32-35]。

3 展望

EMA与普通PCR、荧光定量PCR和LAMP等技术结合用于食品中死活菌的检测效果可靠，集快速、准确、灵敏度高等PCR技术的优点和EMA抑制死菌DNA扩增的优点于一体，不仅在检测食品中对人体有害的活体微生物方面应用前景广泛，在水体微生物、环境微生物和人畜病原早期快速检测等方面应用潜力巨大[36-38]。2015年，Gorzata等[39]研究荧光定量PCR可以定量诊断废水中的死活微生物（大肠杆菌和沙门氏菌），其中EMA预处理是定量分析活菌的关键步骤。2007年，Pisz等[40]采用EMA与荧光定量PCR结合研究环境样品中的死活菌。2015年，Moreno等[41]采用EMA/PMA与荧光定量PCR结合研究甲型肝炎病毒（HAV）的感染与传播。

从分子层面上来看，DNA检测历经了普通PCR和荧光定量PCR方法，实现DNA从定性到相对定量的检测。数字PCR（digital PCR，dPCR）是近年来发展起来基于核酸分子的绝对定量检测技术，该方法在传统的PCR扩增前将含有核酸分子的反应体系进行有效分割，通过PCR扩增和荧光信号的积累读取阳性反应单元数，再通过泊松分布计算出样本的DNA分子数目[42-44]。dPCR的定量检测限比传统定量PCR低，特异性和重复性和传统定量PCR也存在极大的优势。鉴于这种微滴反应能极大程度分散反应体系，可以有效消除抑制因子的作用，保证检测过程中的扩增效率，对检测低含量目标核酸分子的样品有良好的效果[45]。因此，在后续的研究中，可以将EMA与数字PCR结合，用于活体微生物绝对定量检测。

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Advances in Detection of Viable Bacteria Using Ethidium Monoazide Bromide and PCR Technology

LÜ Qiang1，JIANG Zhao-xing2，WANG Hai-yan1，ZHAO Lin-li1，CAO Xu2，CUI Qiang1，ZHAO Zhi-guo1，*，GUO Tie-zheng1，LIU Lai-jun1
（1.The Inspection and Quarantine Technology Center of Inner Mongolia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hohhot 010020，Inner Mongolia，China；2.Chifeng Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chifeng 024000，Inner Mongolia，China）

Microbiological examination plays an important part in food safety，but based on the traditional culture method is difficult to achieve result timely and accurate.PCR technology has opened up a new way for the rapid detection of microbes，however，it can not distinguish the dead and viable bacteria.Ethidium monoazide bromide （EMA）combined with PCR，can rapidly and accurately detect viable microorganisms from food，therefore reducing the incidence of food safety incidents.In this review，we summarized recent progresses on EMA combined with PCR，RT-PCR and LAMP technology for detecting the viable bacteria in food.

Ethidium monoazide bromide；PCR technology；viable bacteria

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.043

国家质检总局科技计划项目（2016IK165）

吕嫱（1987—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品科学。

*通信作者：赵治国（1983—），男（蒙古），高级兽医师，研究方向：食品安全与动物检疫。

2017-04-01