传统白酒发酵过程中微生物种类及功能研究进展

赵龙飞，周文和

（1.商丘师范学院生物与食品学院，河南商丘476000；2.河南林河酒业有限公司，河南商丘476000）

传统白酒发酵过程中微生物种类及功能研究进展

赵龙飞1，周文和2

（1.商丘师范学院生物与食品学院，河南商丘476000；2.河南林河酒业有限公司，河南商丘476000）

发酵过程中的微生物种类影响白酒品质的形成和产量高低，着重从四大类微生物（酵母菌、霉菌、细菌、放线菌）角度，探讨发酵过程中微生物对白酒品质形成的影响，旨在为利用微生物改良白酒品质提供思路，为白酒生产奠定基础。

白酒；发酵；微生物；酵母菌；霉菌；细菌；放线菌

Abstract：The microbial species affected the formation of liquor quality and yield during the process of fermentation.Taking microbial four categories as clues，we discussed the effect of microorganisms on liquor quality formation.It provided ideas for using microbiology to improve liquor quality，laid the foundation for liquor practice production.

Key words：liquor；fermentation；microorganisms；Saccharomycetes；Mould；Bacterium；Actinomycetes

白酒酿造在我国具有悠久历史，传统白酒主要是蒸馏酒[1]，以高淀粉质原料为发酵基质，以传统酒曲为糖化剂，采用固态、半固态或液态发酵方式，经蒸馏、陈化和调勾而成含酒精的饮品，被列为世界著名蒸馏酒之一。因为发酵基质、酒曲种类、发酵工艺以及自然地理环境等差异，最终形成了不同特色、不同香型的白酒。尽管目前白酒的香型和风味呈现多种样，白酒酿造和风味形成的关键仍取决于代谢过程的微生物的基础作用和生物调节，这两个环节决定了发酵进程及风味成分[2]。针对微生物在白酒发酵过程中的作用已有许多相关研究[3]，但是以发酵过程中的微生物种类及功能来阐述的文献还相对较少。因此，本文主要以白酒发酵过程中微生物四大类为线索来阐述微生物的作用和地位。

1 酵母菌

酵母菌（Saccharomycetes）属于单细胞真菌，划为兼性厌氧菌，喜生活于含糖量较高的偏酸环境[4]。酵母菌本身含有丰富蛋白质，尤其是含有13种酶系统（蔗糖酶、麦芽糖酶、己糖磷酸化酶、脱羧酶、脱氢酶，氧化酶、醛缩酶等等），生理活性物质如氧化还原酶的辅酶烟酰胺类、脱羧酶的辅酶CoA、辅酶Q、呼吸链中的重要的组成成分细胞色素C、还原型的谷胱甘肽和核糖核酶等[5]；同时具备人体所必需的8种必需氨基酸、B族维生素（B1～B8和 B11）、维生素 D 原、碳水化合物、粗纤维素、脂肪、矿质元素和微量元素等。此外，在厌氧条件下，酵母菌利用糖代谢的原理，通过糖酵解途径，将糖经过一系列的酶促反应转化成丙酮酸，丙酮酸再在无氧的条件下，经乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶转化成乙醇。酒类发酵过程中，酵母菌分泌的胞外酶作用于发酵基料并使其分解，通过系列酶促反应，最终使产物间发生氧化、还原、脱水、水解等复杂反应，从而形成香、纯、厚等不同风味的酒类。控制优势菌（酿酒酵母）在不同发酵时期的数量变化可以控制醇的产量以及决定白酒品质。所以酵母菌在厌氧发酵这一环节显得尤为重要。如生香酵母（产脂酵母、产膜酵母）在白酒发酵工艺上的应用，使白酒品质和产量得到大大改善。由于其好气性特点，代谢过程中产生大量脂类物质，是酿制白酒产香菌种[6]。鲁氏酵母在酱醪发酵过程中，通过糖酵解途经，将葡萄糖分解为丙酮酸再脱羧形成乙醇。从酱香型白酒高温堆积糟里分离具发酵能力的酵母[7]（意大利酵母、地生酵母、酿酒酵母及假丝酵母），证实了葡萄糖与蛋氨酸在意大利酵母作用下发生美拉德反应，是浓郁芝麻香（主要是3-甲硫基-丙醇-1及5-羟基麦芽酚）风味产生的主要菌类。在经前期堆积发酵的酒醅中，筛选、增殖大量产酒产香的酵母菌，配合各种微生物利用营养物质间发生各种反应相互偶联的影响，形成了酱香或酱香前提物质（呋喃酮、吡喃酮衍生物），经后发酵逐步形成了独特的酱香风味。

随着分子生物学技术发展，对传统白酒发酵过程中微生物的研究和功能探索不断深入。对酱香型白酒发酵过程中酵母菌群落结构分析采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）和实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）技术[8]，对白酒香型起着重要作用的酵母主要包含9种，如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulasporadelbrueckii）、毕赤酵母（Pichiagaleiformis）、酿酒酵母（S.cerevisiae）、溶磷白地霉（Galactomyces geotrichum）、耐碱酵母（Trichosporon asahii）、拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）和费比恩毕赤酵母（P.fabianii）。监测酒精发酵过程中酵母菌群菌落结构的变化，何培彦等[9]采用 Delta-PCR、ERIC-PCR和RAPD-PCR分子生物学技术，实验证明是可行的。在发酵的不同阶段这些酵母菌之间处于不断的消长状态，对形成白酒的香味的形成起着非常关键作用。

2 霉菌

霉菌（Mould）在自然界中广泛分布，属于菌丝体较发达、孢子具较强抗逆性的真菌类型，其菌丝体由分支或不分支的菌丝构成，菌落较疏松、干燥，呈蛛网状、绒毛状、毡状等，故繁殖能力较强。同人类的生产、生活关系密切，是人类实践活动中最早认识和利用的一类微生物[4]。霉菌在白酒酿制车间的数量均小于细菌和酵母菌[8]。霉菌在酒曲中有多种，如曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）、青霉（Penicillium）、红曲霉（Monascus）等，大量着生于酒曲表面并生成孢子，因其抗逆特性在高温高湿环境下可以繁殖与代谢，它们产生的多种水解酶类是发酵前期原料中淀粉等大分子物质降解的主要动力，对白酒品质的形成具有基础性促进作用。此外，霉菌在生长过程中利用发酵基料代谢产生一些呈香物质，对白酒风味形成具有一定影响。

白酒发酵过程中，霉菌代谢除了可产生柠檬酸、葡萄糖酸、草酸等有机酸外，还可产生多种酶制剂如糖化酶、液化酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯化酶、果胶酶、漆酶等。此外，代谢产生的壶角甾醇具有抑制癌细胞活性功能，产生的麦角固醇是维生素D2的前体物，可抵抗伤痛[10]。因此，霉菌对前期原料降解、增加香型、赋予酒的保健功能等方面起着重要作用。霉菌种类、数量、分布等对白酒发酵过程及最终产物影响重大，尤其是对酿酒能产生直接作用的功能菌群结构，它们之间相互作用彼此消长，对白酒香型、产量和品质都产生直接的影响[11]。

窖内发酵过程中，霉菌主要来源于酒曲和糟醅在堆积过程中所滋生的霉菌，因其好氧性在发酵前期数量较多，其功能主要是参与淀粉质原料的糖化过程。随后霉菌数量呈下降趋势，到发酵中后期有所回升，并逐渐趋于稳定[12]。对茅台酒酒醅中分离获得的16种霉菌[11]，包括毛霉（Mucor）、根霉（Rhizopus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、烟曲霉（A.fumigatus）、亮白曲霉（A.candidus）、拟青霉（Paecilomyces）、红曲霉（Monascus）、紫红曲霉（M.purpureus）、红色红曲霉（M.ruber）、丛毛红曲霉（Monaseus pilosus）、嗜热棉毛菌（Thermomyces lanuginosus）等。对不同阶段酱香型白酒发酵酒醅中霉菌研究[13]发现：窖池内上、中、下不同层次酒醅中霉菌数量变化基本一致，即发酵开始霉菌数量急剧下降，中期数量短暂回升，后期菌体数量再次呈现减少趋势直至发酵结束。因此，在白酒发酵过程中霉菌的数量、种类随发酵进程进行不断变化，窖池内酒醅中霉菌种群、生态和时空分布及代谢产物间的多寡和差异，对不同层次酒醅酒体和风味形成都有一定影响。

3 细菌

细菌（Bacterium）是一类细胞细短、结构简单、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物，喜在温暖、潮湿和富含有机质的环境生存[4]。在传统白酒发酵过程中，细菌种群扮演着非常重要的角色。发酵中所用酒曲中的细菌，主要能功是分泌淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等水解酶类，淀粉酶分解酒醪中的多糖类成分，最终获得单糖以及二糖和环糊精等；糖化酶主要是它能把淀粉从非还原性未端的直链上的以α-1.4葡萄糖苷键链接的葡萄糖水解成单个的葡萄糖，同时也能缓慢水解分支上的α-1.6葡萄糖苷键，进一步转化为葡萄糖。蛋白酶主要使水解化学性质是蛋白质的酶类，使其由无活性状态转化到由活性状态，这些酶水解发酵基料得到可用性糖和氨基酸。

中国传统白酒生产的基础使窖泥，大量的实验表明：窖龄越大，微生物的数量和种类越多，长龄窖的窖泥中已经分离出的己酸菌、丁酸菌等细菌类微生物。同时，细菌在制曲过程中也可积累一些酱香物质或香味前体物以达到增香效果[14]。Li等[15]研究表明，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）在发酵大曲中不仅是优势菌种，且有较高α-淀粉酶、葡糖糖化酶活性。对比发现，蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、奥列伦芽孢杆菌（B.oleronius）在德山和武陵大曲中既是优势菌种也是α-淀粉酶和葡糖糖化酶的优良菌种。随着发酵进程细菌多样性下降，接近发酵结束耐酸乳酸菌（Lactobacillus acetotolerans）变成优势种群。但不同的上游生产工艺也决定了发酵中间阶段不同的细菌群落。在高香型白酒发酵过程中，占据优势的细菌种群主要是芽孢杆菌（Bacilli）、拟杆菌（Bacteroidetes）和梭状芽孢杆菌（Clostridia），而芝麻香型发酵优势菌属于芽孢杆菌、黄杆菌（Flavobacteria）和γ-变形杆菌（Gammaproteobacteria）[16]。在发酵过程中，微生物的代谢产物、高分子化合物的降解产物及它们之间的相互作用形成了白酒呈香呈味物质，其种类、含量及协调比例决定了白酒品质。王涛等[17]研究表明，从发酵酒醅中分离的603株菌中599株属于34属101种，其中芽孢杆菌、链霉菌（Streptomyces）、赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）4个属为优势菌。以产芽孢或孢子的细菌为显著优势菌，因其抗逆性强能适应多变环境，在一定程度上表明浓香型白酒生产所形成的高酸、高乙醇、较高温度与湿度环境下细菌群落具有一定多样性和相对稳定性，对浓香型白酒品质的形成起着关键作用。王文晶等[3]研究表明，酱香型白酒酒醅中的优势细菌种类基本相似，细菌包括地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、同型腐酒乳杆菌（L.homohiochii）和布赫内氏乳杆菌（L.buchneri），对酱香型白酒风味物质的形成起到重要作用。研究[18]表明，芽孢杆菌可以产生酱香味，因此，使用产酱香芽孢杆菌制成细菌曲应用于发酵过程中，起到强化大曲的作用，可以改善北方酱香酒的品质。地衣芽孢杆菌在发酵过程中产生的代谢物发生美拉德反应（Maillard reaction），经过复杂的历程形成特殊的系列挥发性物质香味物质；加上高温多水的工艺环境为嗜热芽孢杆菌提供了良好的生长条件，更近一步促进了美拉德反应的发生。因此，利用细菌中芽孢杆菌可达到生成大量酱香物质，逐步成为从细菌角度改善白酒品质关注的焦点。

4 放线菌

放线菌（Actinomycetes）主要是一类呈丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物，作为一类生活史和生理生化特征相对独特的微生物类型，其种类繁多、代谢功能各异，广泛分布于含水量较低、有机物丰富、呈弱碱性的土壤中。大多数放线菌是有益菌，对纤维素有极强分解能力，是许多酶、维生素、抗生素的生产菌株[4]。目前，已发现由放线菌合成的次级代谢产物占微生物来源生物活性物质的50%以上。放线菌在高温大曲里数量极少，一般认为它的作用微小。但有研究[2]表明，放线菌作为白酒发酵过程中四大菌类之一，对酒体风味和风格具有一定影响。相对其他三大类微生物，链霉菌属（Streptomyces）属放线菌能够耐受厌氧环境，且能完成无氧条件下发生的代谢，还未引起足够的重视[19]。迄今，对放线菌大部分研究主要集中在对菌株的筛选、鉴定[20]、产酸产酯及对环境酸碱度的影响[21]，针对白酒固态发酵过程中放线菌产香功能和从微生态角度研究相对较少，但其某些独特代谢产物具有土腥味（土腥味素）等特征，对白酒风味的影响不可忽视。国外已有放线菌挥发性产物相关研究的报道[22]。游玲等[23]研究表明，分离自浓香型白酒发酵糟醅、窖房和曲房空气中的4株链霉菌（S.mutabilis、S.vinaceusdrappus、S.coelicoflavus、S.violascens） 可产生挥发性产物如丁酸、己酸、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯及糠醛等，它们是对浓香型白酒风味有重要影响的醇溶性和水溶性挥发性产物，且它们对高酸、高乙醇含量的环境适应良好。关于放线菌对发酵过程中功能性微生物群落的整体性生物学调控和风味调控机理有待深入研究[2]。

5 展望

统览近10年（2006～2016）文献，对白酒发酵过程中微生物的研究主要集中在优良模式菌株的筛选和鉴定，而对发酵过程中有益微生物间的互作探索较少；对于微生物发酵区系中，影响白酒品质和风味的主要微生物种类、数量及时空分布研究不够深入。目前，对传统白酒发酵过程中产香微生物与香味物质间的对应关系研究还处于起步阶段，将成为白酒研究的重要方向。欲弄清白酒发酵的本质，利用现代分子生物学技术结合传统发酵技术，运用分组测序技术、代谢组学、基因组学、蛋白组学、聚合酶链式反应-温度梯度凝胶电泳/变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Temperature Gradient Gel Electrophoresis/Denatured Gradient Gel Electrophoresis，PCR-TGGE/DGGE）、实时定量聚合酶链式反应（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）、核酸探针技术、克隆文库等技术分析发酵过程中微生物种群结构和数量变化，从微生物生态学角度探索不同发酵阶段微生物群落间演替变化规律，揭示微生物与代谢产物间的关系，对实际生产中改善白酒品质和提高产量具有深远意义。

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Research Progress on Microorganisms and Function during Traditional Liquor Fermentation

ZHAO Long-fei1，ZHOU Wen-he2
（1.College of Biology and Food Science，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，Henan，China；2.Henan Lin he Wine Corporation Limited，Shangqiu 476000，Henan，China）

2016-12-29

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.043

国家自然科学基金项目（U1204301）；河南省高等学校重点科研项目（17A180011、18B180022）；国家级大学生创新性实验计划项目（201610483021）

赵龙飞（1978—），男（汉），副教授，博士，主要从事微生物资源与应用研究。