微生物法降解玉米芯制备燃料乙醇的研究

李永莲,刘文锋,阳元娥,周亮,黎彧

（广东轻工职业技术学院，广东 广州 510300；五邑大学，广东 江门 529020）

微生物法降解玉米芯制备燃料乙醇的研究

李永莲,刘文锋,阳元娥,周亮,黎彧

（广东轻工职业技术学院，广东 广州 510300；五邑大学，广东 江门 529020）

研究微生物法酶解玉米芯的最佳工艺和酵母菌发酵的最佳工艺。方法：采用自筛微生物L2″对玉米芯进行酶解，酵母对酶解液进行发酵。结果：酶解条件：自筛微生物L2″用量30m L pH值为7.0，温度35℃，酶解时间48h，还原糖浓度达到最高；发酵条件：酵母接种量40m L，发酵温度35℃，发酵时间36 h，酒精产量最高。结论：自筛微生物L2″适合用以酶解玉米芯，在较佳的酶解和较佳的发酵条件下，可显著提高酶解率和发酵率。

玉米芯；微生物法；酶解；发酵

随着世界经济的全面发展，人类将需要越来越多的能源。因为化石能源是不可再生的，其储存量将越来越少，将会面临短缺危机；且化石能源污染环境，因此可再生能源的开发利用将越来越受到重视。燃料乙醇因环保无污染，并支持汽油充分燃烧，受到越来越多的关注。我国玉米年产量居世界第二，但是大量玉米芯因无法利用被废弃而造成极大的浪费。如果利用玉米芯制备燃料乙醇，则环保又经济，具有重要的社会效益和经济效益[1]。本文采用玉米芯为原料，研究利用自筛的微生物对其进行降解及发酵制备乙醇的技术路线，以探究玉米芯进行发酵燃料乙醇的可行性和经济性，为玉米芯的综合利用提供理论依据。

一、材料和方法

（一）材料

玉米芯购自广西桂林，晒干、粉碎、过60目筛、恒重，置样品袋中储存备用[2]；微生物菌L2"是广东工业大学天然药物与绿色化学研究所培养筛选得到；酿酒酵母购买自安琪酵母股份有限公司。

（二）培养基

微生物菌L2″活化培养基，即是PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂16g，蒸馏水1000m L。酵母活化培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000m L。

（三）菌种制备

微生物菌L2″以PDA斜面于4℃储藏，在微生物法预处理玉米芯前，接种到PDA液体培养基，置于35℃培养24h，菌丝长满液面。预处理时，将长满菌丝的液体接种到每个样品[3]。

酿酒酵母S.cerevi si ae，利用安琪酿酒高活性干酵母培养，以PDA斜面于4℃保存，在发酵制备乙醇前，接种到酵母活化液体培养基中活化。

（四）实验方法

称取已恒重的玉米芯样品10.0g，按固液比1：12加入1.0%（质量分数）稀H 2SO 4，设置2个重复实验，放置湿热高压灭菌锅在121℃的温度下预处理1h，自然冷却至室温，用稀N aO H溶液调节pH 4.8～5.0，过滤。预处理后，在玉米芯水解液中加入自筛选培养的微生物菌L2"，放置温控摇床，设置一定温度和转速进行酶解。酶解后，加入酿酒酵母S. cerevi si ae发酵液，放置于温控摇床，设置一定的温度和转速进行发酵[4]。

（五）测定方法

还原糖含量测定：3，5-二硝基水杨酸法(DN S法)[5]；乙醇含量测定：气相色谱法（GC）。

二、实验内容

（一）微生物酶解的影响因素研究

1、菌用量

预处理后，加入24h活化的L2〞微生物菌液10、20、30、40、50m L，设计2个重复，调节pH至7.0，置于35℃、100rad/m i n恒温摇床中培养48h。

2、温度

预处理后，加入24h活化的微生物菌L2〞30m L，设计2个重复，调节pH至7.0，分别置于不同温度：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，100rad/m i n的恒温摇床中培养48h。

3、pH值

预处理后，加入24h活化的微生物菌L2〞30m L，设计2个重复，调节不同的pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后置35℃，100rad/m i n的恒温摇床中培养48h。

4、时间

预处理后，加入24h活化的微生物菌L2〞30m L，设计2个重复，调节pH至7.0，置于35℃，100rad/m i n的恒温摇床中培养60h，每隔4h取样2.0m L。

（二）发酵的影响因素研究

1、酵母接种量

酶解液中，分别加入20、30、40、50、60、70m L活化后的酿酒酵母S.cerevi si ae发酵液，密封，置于恒温摇床，在35℃、100rad/m i n下发酵36h后停止，精馏发酵液，采用气相色谱法检测乙醇产量[6]。

2、温度

在酶解液中加入40m L活化后的酿酒酵母S. cerevi si ae发酵液，密封，置于恒温摇床，设置发酵温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，在转速100rad/m i n下发酵36h后停止，精馏发酵液，采用气相色谱法检测乙醇产量[6]。

3、时间

在酶解液中加入活化后的酿酒酵母S. cerevi si ae发酵液40m L，密封，置于恒温摇床，在35℃、100rad/m i n下分别发酵12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h停止，精馏发酵液，采用气相色谱法检测乙醇产量[6]。

三、结果与讨论

（一）微生物酶解的影响因素

1、菌用量的影响

降解生物质的活性物质主要是纤维素酶，但是目前纤维素酶的价格较高，因此目前制备燃料酒精的酶解过程关键环节是降低纤维素酶的成本[6]。研究了自筛微生物L2〞产生纤维素酶后进行玉米芯酶解效果的研究及最佳用量的研究。如图1所示，自筛微生物L2〞进行玉米芯酶解产生了较佳的效果，玉米芯的酶解开始随着菌用量的增加而加快。但是当菌用量到30m L时，继续增大菌用量时酶解效果反而使还原糖浓度下降，原因可能是当在底物玉米芯用量一定的情况下，菌用量的增加有利于玉米芯酶解为还原糖，但是水解玉米芯也要消耗一部分还原糖以满足微生物代谢需要，所以当微生物量过大，单位时间内微生物自身代谢消耗的还原糖量超过其酶解玉米芯得到的还原时，还原糖含量开始下降。因此自筛微生物L2〞酶解玉米芯的效果是明显的，其最佳菌用量为30m L。

图1 菌用量对微生物酶解的影响Fig.1 The effect of dosages

2、温度的影响

温度的变化影响微生物的生产速度、酶活力和酶促反应速率，温度过高或者过低都会导致微生物不生长甚至死亡，酶活力和酶促反应速率降低甚至被破坏，所以需要寻找微生物的最适温度。如图2所示，自筛选微生物的最适生长温度为35℃，此时还原糖的含量较高。当温度过低时微生物生长缓慢，分解的纤维素酶较少，导致还原糖含量低；温度过高则微生物生长会受到抑制或导致死亡，导致还原糖含量下降。

图2 温度对微生物酶解的影响Fig.2 The effect of temperature

3、pH值的影响

pH值的变化会影响微生物的生命活动、代谢过程酶活性。微生物都有最适pH值和一定的pH范围，在最适范围内生长速率最快，酶活性最高，催化作用最强；过酸过碱会导致微生物的生长受阻，甚至死亡。如图3所示，微生物L2〞的最适pH为7.0，此时还原糖浓度最高。

图3 pH值对微生物酶解的影响Fig.3 The effect of pH

4、时间的影响

如图4所示，酶解时间增加，微生物充分接触玉米芯，还原糖浓度增大，48h时还原糖量最大，而后还原糖的浓度不会再随着酶解时间的延长而增加，反而略有降低。分析其原因可能主要有两点：（1）微生物与底物玉米芯的结合在一定的酶促时间达到饱和[6]；（2）微生物分解纤维素酶的能力随着时间的增加而降低。

图4 时间对微生物酶解的影响Fig.4 The effect of time

（二）发酵过程的影响因素

1、酵母接种量的影响

如图5所示，在开始的一段时间，随着酵母接种量的增加，酒精的产量增大；但是当酵母接种量到40m L后，酵母接种量的增加反而使得酒精的产量减少。其原因[7]可能是：（1）酵母接种量过大时，酵母菌的生长消耗了大量的还原糖；（2）产物酒精的增多抑制酵母发酵。

图5 酵母接种量对发酵的影响Fig.5 The effect of yeast dosages

2、温度的影响

温度对酵母菌的生长和发酵有关键作用。由图6可知，随着温度的升高，酒精的产量增大，35℃最高，温度继续升高产量反而降低，可知35℃为最适的发酵温度。原因可能是：（1）酵母的生长和发酵有最适温度，过高或者过低都不利于酵母作用；（2）温度过高导致乙醇挥发以致不能收集。

图6 发酵温度对发酵的影响Fig.6 The effect of fermentation temperature

3、时间的影响

由图8可见，发酵时间在36h左右时，酒精产率达到最高值，继续延长发酵时间后呈平缓趋势，甚至慢慢降低。其原因可能有：当酒精浓度达到一定时，酵母生长受到抑制，导致酒精增加缓慢，继续发酵，部分乙醇因挥发而导致产率略有下降。

图7 时间对发酵的影响Fig.7 The effect of time

四、结论

(一)酶解最佳条件：自筛微生物L2〞适合用于酶解玉米芯，其用量最适为30m L，pH值最适为7.0左右，温度最适为35℃，酶解时间最适为48h，在这样的条件下，还原糖的浓度达到最高。

(二)发酵最佳条件：酿酒酵母S.cerevi si ae发酵液接种量最适为40m L，发酵温度最适为35℃，发酵时间最适为36h，酒精产量最高可达0.42g/g葡萄糖，与理论值0.51 g/g葡萄糖相比较，产率达到82.3%，这与文献[6]的研究成果基本是一致的。

[1]李永莲.玉米芯预处理工艺及制备燃料酒精的研究[D].广州：广东工业大学，2011.

[2]马晓轩，范代娣，马沛等.秸秆微生物降解及发酵生产乙醇的研究[J].西北大学学报(自然科学版)，2009，39（1）：71-74.

[3]阮奇城，祁建民，胡开辉等.白腐真菌Pleurotus sajor-caju预处理对红麻秸秆发酵乙醇的影响[J].生物工程学报，2011,27（10）：1464-1471.

[4]李永莲，张焜，赵肃清.玉米芯稀硫酸预处理后酶解及酒精制备研究[J].酿酒科技，2011，（04）：17-19.

[5]宋占午,壬莱,刘艳玲.3,5-二硝基水杨酸测定还原糖含量的条件考察[J].西北师范大学学报(自然科学版),1997，(33)：52-55.

[6]李永莲，刘文锋，阳元娥.酶法降解玉米芯以制备燃料乙醇的研究[J].广东技术师范学院学报，2014，（07）：：4-51.

[7]Nobuhiro Nakamura,Ryosuke Yamada,Satoshi Katahira. Effective xylose/cellobiose co-fermentation and ethanol productionbyxylose-assimilatingS.cerevisiaevia expression of?-glucosidase on its cell surface[J].Enzyme and Microbial Technology,2008(43)：233-236.

TU741

A

1671-5993（2017）01-0067-04

2016-11-1

广州市科技局项目：高档羽绒杀菌除臭绿色新工艺的研究（201510010170）

李永莲（1985-），女，广东韶关人，工程师，工学硕士，主要研究生物资源的利用与开发。