鸡NLRC5启动子区转录调控序列的初步研究

张 莘，郭晓敏，常国斌，朱鹏飞，徐 璐，仇玲玲，张 扬，徐 琪，陈国宏

(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

鸡NLRC5启动子区转录调控序列的初步研究

张 莘，郭晓敏，常国斌*，朱鹏飞，徐 璐，仇玲玲，张 扬，徐 琪，陈国宏

(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

为了探讨NLRC5启动子的潜在调控机制，将NLRC5基因启动子系列缺失片段插入到pGL3-basic载体，构建重组质粒，并转染DF1细胞系。通过双荧光素酶实验寻找核心调控区，然后用目标捕获测序检测27个鸡品种的NLRC5核心启动子区的SNPs，并利用TRANSFAC，JASPAR 和 MethPrimer预测该区域的转录因子结合位点和CpG岛。结果显示，NLRC5启动子有2个核心区域，分别是1—617和1448—2108。第一个核心区域内存在3个SNPs，其中SNP1影响转录因子Hic1的结合序列，但SNPs对CpG岛不产生影响，表明NLRC5基因的启动子区的调控可能受不同因素的影响，但SNPs并不在甲基化的水平上影响启动子的活性。

鸡；NLRC5启动子；SNPs；转录因子结合位点；CpG岛

先天免疫和适应性免疫是动物宿主防御病毒、细菌和寄生虫等病原体的2种免疫防御形式，多种模式识别受体识别病原体进而激活相应的免疫反应[1-2]来进行防御。目前，已发现4种模式识别受体家族，分别是 TLRs(Toll-like receptors)、CLRs(C-type lectin receptors)、RLRs(RIG-I-like receptors) 和 NLRs(NOD-like receptors)[1，3]。NLRC5蛋白属于NLR家族[4-5]，包含N端CARD、中心NACHT、C端LRRs 3个结构域。文献报道NLRC5表达于多种细胞和组织，免疫组织和器官表达水平较高[3,6-7]。有大量研究表明，NLRC5在先天免疫和适应性免疫中都发挥着重要的作用，但本身的调控机制还不清楚，而启动子的调控在转录环节中占据着至关重要的地位，国内关于NLRC5启动子的结构和调控等的研究较少，本研究克隆了NLRC5的启动子区，即起始密码子前4 372 bp，并将不同长度的启动子片段插入pGL3-basic载体中构建系列缺失载体，转染DF1细胞，利用双荧光素酶实验来反映不同长度启动子片段的活性来确定核心区域，检测核心区域内SNPs，并进行转录因子结合位点和CpG岛预测，以期通过对NLRC5启动子区的初步分析，为NLRC5调控等提供信息和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和细胞系

本研究使用的细胞系和27个鸡品种分别是：DF-1细胞系、红色原鸡(RJ)、茶花鸡(CH)、藏鸡(ZC)、白耳鸡(BE)、仙居鸡(XJ)、绿壳蛋鸡(GS)、太湖鸡(TH)、如皋鸡(RG)、萧山鸡(XC)、北京油鸡(BY)、固始鸡(GS)、狼山鸡(LS)、大骨鸡(BB)、青脚麻鸡(QJ)、广西黄鸡(GY)、文昌鸡(WC)、丝羽乌骨鸡(SC)、雪山草鸡(XS)、鹿苑鸡(LY)、溧阳鸡(LC)、斗鸡(DJ)、斗鸡与罗斯鸡杂交后代(DR)、来航鸡(LH)、罗斯鸡(RC)、AA鸡(AA)、安卡鸡(AK)、隐形白洛克(RW)。其中DF-1细胞购自北京北纳创联生物技术研究院，用添加10%胎牛血清的DMEM培养基培养。27个鸡品种中XJ、CH、LY、BE、ZC、GS、BB、DJ、LS、SC、XC、BY等12个地方鸡品种来自中国农业科学研究院家禽科学研究所国家地方禽种资源基因库，RJ亚种采自云南省野生动物救护中心，另外14个鸡品种来自扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室禽种资源基因库。

1.1.2 主要试剂

SYBR®PreniExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、Prime STAR®GXL DNA Polymerase、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA Ligation Kit Ver.2.1、DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司；双荧光素酶报告基因载体pGL3-basic和pRL-SV40、FuGENE®HD Transfection Reagent、Dual-Luciferase®Reporter Assay System购自Promega公司；无内毒素质粒大提试剂盒、FastQuant RT Kit、离心柱型普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根公司；胎牛血清、DMEM培养基、胰酶来自Hyclone；限制性内切酶KpnⅠ和NheⅠ来自Thermo。

1.1.3 主要仪器

AG-2233Mini式小型高速离心机和普通PCR仪为Eppendorf公司，Nano Drop 1000分光光度计、CO2培养箱来自Thermo公司，凝胶成像系统Gel Doc TM EZ imager、自动细胞计数仪购自BIO-RAD，DK-600 恒温水槽和隔水式恒温培养箱购自上海精宏，还有7500荧光定量PCR仪(ABI)、AllegraTMX-22R离心机(Beckman)、超低温冰箱(海尔)、恒温振荡器(培英)、琼脂糖凝胶电泳系统(北京六一)、IX71 荧光倒置显微镜(OLYMPUS)、Synergy 2 化学发光检测仪(Bio Tek)、SW-CJ-1F型无菌超净工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.2 DNA提取

每个鸡品种收集10个样本，翅静脉采血1 mL，置于盛有0.1 mL肝素钠抗凝剂的2 mL离心管中用于提取基因组DNA，选择完整性好(无拖尾现象)，D260/D280介于1.8～2.0之间的DNA样品稀释至50 ng·μL-1。

1.3 系列缺失表达载体的构建

根据GenBank上红色原鸡NLRC5基因序列(Gene ID: 100857413)，采用系统缺失的方法设计引物(表1)，运用PCR技术扩增NLRC5启动子，使用KpnⅠ和NheⅠ限制性内切酶双酶切PCR纯化产物和pGL3-Basic质粒，切胶回收后进行连接，然后转化DH5α感受态细胞，经菌液PCR、酶切、测序鉴定正确后，无内毒素质粒大提试剂盒提取，-20 ℃保存、备用。

将构建的系列缺失表达载体转染DF1细胞系，转染前将细胞以5×105的密度接种在24孔板中，待细胞完全贴壁生长至80%融合度时，参照FuGENE®HD Transfection Reagent转染试剂的使用说明书，分别将各目的质粒与内参质粒共转染到细胞中。24 h后检测其双荧光素酶活性。

表1 NLRC5启动子系列缺失表达载体构建引物

Table 1 Primers for deletion plasmids construction of chickenNLRC5 promoter

名称Name引物序列Primersequence(5'-3')产物Product/bp作用FunctionP1-FGGGGTACCATGAGAGGAAGTGCAAGTATCTGTTCAGGCAGCAGG4372构建P1ConstructingP1P1-RCGGCTAGCTGCTGTGTGGTCAGCCTCCCTTCAGTCGP2-FGGGGTACCGCGGCGCCGCGCTTTCACTTTTG3756构建P2ConstructingP2P2-RCGGCTAGCTTGCTGTGTGGTCAGCCTCCCTTCAGTCP3-FGGGGTACCGAACCCCCATCCACCCTCTGTGG2925构建P3ConstructingP3P3-RCGGCTAGCTTGCTGTGTGGTCAGCCTCCCTTCP4-FGGGGTACCAGCAGTAAGTTGTGAATTCATGAGAGAGGACG2265构建P4ConstructingP4P4-RCGGCTAGCTTGCTGTGTGGTCAGCCTCCCTTC

下划线为酶切位点；KpnⅠ识别序列GGTACC，NheⅠ识别序列GCTAGC。

Underline indicates restriction enzyme recognition sites;KpnⅠrecognizes GGTACC;NheⅠrecognizes GCTAGC.

1.4 SNP、转录因子及CpG岛检测

运用目标捕获测序检测27个鸡品种NLRC5启动子区的SNPs。利用在线软件TRANSFAC和JASPAR对转录因子结合位点进行预测，并运用MethPrimer预测目标序列CpG岛(GC含量大于50%，Obs/Exp比值>0.6和CpG岛范围大于100 bp为判定标准)。

1.5 数据分析

对所有的实验数据使用SPSS 21.0软件(SPSS， Chicago， IL， USA)进行分析。用邓肯氏法进行多重比较，DNAstar软件比对DNA测序结果。利用Microsoft Excel 2010对以上分析所得数据进行整理归纳。

2 结果与分析

2.1 系列缺失载体双荧光素酶活性实验结果

为了寻找NLRC5启动子的核心区域，构建了4个缺失载体，经酶KpnⅠ单酶切、酶KpnⅠ和NheⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳，结果如图1，单酶切后条带单一，双酶切后得到线性载体片段和NLRC5启动子目的片段，大小和设计预期相同，载体构建正确，可用于后续实验。

上述4个缺失载体的双荧光素酶实验结果(图2)显示片段P1的活性是片段P3的83%，并且两者的活性都大于片段P2；片段P4的活性几乎为0，说明删除1—617和1 448—2 109后，活性显著下降，而删除617—1 448后活性上升，2 109—4 372几乎没有启动子活性，初步推测NLRC5启动子存在2个活性区域，分别为1—617和1 448—2 109。

2.2 不同鸡种的SNP

本研究利用目标捕获测序检测27个鸡种NLRC5启动子区SNPs，将测序结果中reads超过50%的低质量碱基去除[quality value≤5 (E)]后的结果如表2、表3所示，共发现3个SNPs位点，其中SNP1位点和NCBI上dbSNP数据库不匹配。表3显示了各鸡种NLRC5基因启动子SNPs分布情况，27个鸡种中仙居鸡、大骨鸡、文昌鸡、丝羽乌骨鸡、安卡鸡、隐形白洛克6种鸡种没有SNPs，其他鸡种中SNP1出现的比例最高，SNP3仅存在于茶花鸡、太湖鸡、斗鸡以及斗鸡和罗斯鸡杂交后代中。除茶花鸡和太湖鸡中含有3个SNPs外，其余鸡种SNPs大致相同。这些SNPs与NLRC5的表达调控和鸡的性状之间的关系还需要进一步验证。

M为DNA相对分子质量标准；P1～P4为4个缺失载体Letter M represented DNA relative molecular mass standard; Letter P1 to P4 represented 4 deletion plasmids图1 鸡NLRC5启动子系列缺失载体的单酶切(A)和双酶切(B)琼脂电泳结果Fig.1 Single and double restriction enzyme digestion products of plasmids of NLRC5 promoter

左边显示插入pGL3-basic载体的不同区域启动子片段，右边显示缺失载体的相对荧光素酶活性，数据表示为3个重复的平均数±标准差，不同的小写字母表示数据间差异显著(P<0.05)The left showed the different length promoter fragments inserted into pGL3-basic vector. The right showed the relative luciferase expression activities of corresponding constructs. Data were expressed as mean±SD of 3 repeats. Different lowercase letters represented significant difference(P<0.05)图2 鸡NLRC5启动子系列缺失载体的活性Fig.2 Activity of different length of NLRC5 promoter of chicken

2.3NLRC5启动子区转录因子结合位点预测

本研究利用在线软件TRANSFAC和JASPAR对转录因子结合位点进行预测，发现SNP1处于转录因子结合位点，结合转录因子Hic1(图3)，基序为GGGTGGCAT，此处结合序列发生变化，藏鸡、仙居鸡、固始鸡、狼山鸡、大骨鸡、青脚麻鸡、文昌鸡、丝羽乌骨鸡、斗鸡、安卡鸡、隐形白洛克没有这个SNP，NLRC5启动子区SNPs通过影响转录因子结合位点来影响启动子的活性，从而影响基因的表达调控，使机体表现不同的抗病力。

2.4NLRC5启动子区CpG岛预测

本研究利用MethPrimer预测1-617序列CpG岛(图4)，发现存在1个CpG岛，其范围是312～562 bp，大小为251 bp，有2个SNP位点(SNP2和SNP3)位于CpG岛内，将突变后的序列重新提交，发现CpG岛数量和长度均未发生改变。推断SNP位点可能不通过影响启动子区甲基化水平而调控基因表达。

表2 NLRC5启动子第一个核心区域SNP信息

Table 2 SNP in the first core region ofNLRC5 promoter

多态位点信息PolymorphicsiteinformationSNP1SNP2SNP3位点坐标Location/bp217408551突变MutationA/GT/YG/R数据库一致性Databaseconsistency011

0，不匹配；1，匹配；简并碱基Y(C+T)、R(A+G)。

0， Mismatching; 1， Match; Y (C+T); R (A+G).

表3 不同鸡种SNP分布情况

Table 3 SNP status in different chicken breeds

品种BreedRJCHZCBEXJGSTHRGXCBYGSLSBBQJGYWCSCXSLYLCDJDRLHRCAAAKRW总计TotalSNP1++++++++++++++++16SNP2++++++++8SNP3++++4总计Total13110231111101100111121210028

+，存在；空白，不存在。

+， Existence; Blank， Non-existent.

图3 NLRC5启动子第一个核心区域的示意图Fig.3 The first core region of NLRC5 promoter

图4 SNP2和SNP3突变前、后NLRC5启动子第一个核心区域CpG岛预测Fig.4 CpG islands predicted by MethPrimer in NLRC5 promoter

3 讨论

NLRC5可调控NF-κB(nuclear factor-k-gene binding)[8-9]、I型干扰素[6，10]、炎性体信号路径及MHC-I(major histocompatibility complex class I)基因表达[3，11-12]， 表明其在免疫过程中有重要作用。双荧光素酶实验结果显示NLRC5启动子具有1—617和1 448—2 108两个核心区域，本研究主要研究NLRC5启动子1—617核心区域，通过对27个鸡种的测序发现了3个SNPs位点，SNP3位点只在茶花鸡、太湖鸡、斗鸡以及斗鸡和罗斯鸡杂交后代4个鸡种中检测到，仙居鸡、大骨鸡、文昌鸡、丝羽乌骨鸡、安卡鸡、隐形白洛克6种鸡中未发现SNPs，造成这种现象的可能原因是：鸡种受外界环境和遗传条件的影响，不同类型鸡种有不同的表现型，从而导致鸡种的抗病力不同，所以不同类型鸡种的SNPs位点也不相同。到目前为止，大量文献报道了很多基因的启动子区域呈现相对丰富的多态性，并使基因的表达调控发生改变，从而对动物的多种性状产生影响[13-18]，但是这些SNPs位点是否影响鸡种的抗病力需要进一步作缺失来缩短核心启动子区，扩大样本量来寻找核心启动子区的不同单倍型来验证。

有报道称Hic1是抑癌候选基因，在正常组织中广泛表达，但在多种肿瘤中表达缺失[14]。一系列的研究表明Hic1是调节细胞生长及凋亡关键基因的中心转录调节因子，抑制Hedgehog信号通路[18]和调节Wnt信号通路[16]，并且能够调节phrin-A1基因的直接转录，从而抑制上皮肿瘤的形成[17]，所以Hic1应该与机体的免疫有关。有研究表明，NLRC5可正调控Wnt信号通路，进而诱导下游靶基因转录和蛋白表达，从而影响肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭特性[19]。由此可以看出，Hic1和NLRC5之间可能存在一定联系。本研究预测到NLRC5启动子存在该转录因子的结合位点，可能影响NLRC5的转录。另外，SNP1位点位于转录因子结合位点，通过影响转录因子与调控序列的结合来调控基因表达，说明NLRC5启动子区SNPs对启动子调控有影响。有文献报道，DNA甲基化可影响靶基因表达水平[20]，本研究预测到NLRC5启动子区有范围较近的1个CpG岛，并且发现有2个SNPs位点处于预测的CpG岛区，说明DNA甲基化水平对NLRC5表达调控有重要作用。但是SNPs不对CpG岛产生影响，该原因可能是本研究所采用的序列位于核心启动子区，其保守性较强，SNPs位点可能不在甲基化水平上影响NLRC5的表达水平，NLRC5启动子功能和NLRC5的调控机制还需进一步研究探讨。

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(责任编辑 卢福庄)

Preliminary study on transcriptional regulation sequence of chickenNLRC5 promoter

ZHANG Xin， GUO Xiaomin， CHANG Guobin*， ZHU Pengfei， XU Lu， QIU Lingling， ZHANG Yang， XU Qi， CHEN Guohong

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

In order to explore the potential regulation mechanism of chickenNLRC5 promoter， deletion fragments of chickenNLRC5 promoter was cloned and inserted into pGL3-basic vector to construct recombinant plasmids for transfecting DF1 cells. Dual-luciferase assay was carried out to find the core regulation region. Then target sequence capture assay was used to detect SNPs in the core region ofNLRC5 promoter of 27 chicken breeds. Finally， transcription factor binding sites and CpG islands were predicted by using online softwares TRANSFAC， JASPAR and MethPrimer. The results showed thatNLRC5 promoter had 2 core regions， 1 to 617 and 1 448 to 2 108， respectively. There were 3 SNPs loci totally in the first core region in all breeds. SNP1 was found to influence the transcription factor Hic1 binding site. However， SNPs in the first core region did not affect CpG island. The results above suggested thatNLRC5 promoter activity might be regulated by different factors， but SNPs didn’t influence the promoter activity at methylation level.

chicken;NLRC5 promoter; SNPs; transcription factor binding site; CpG island

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.07

2016-10-01

国家科技支撑计划(2015BAD03B03)；江苏省六大人才高峰项目(2015-NY-019)

张莘(1995—)，女，江苏邳州人，本科在读，E-mail: 768655881@qq.com

*通讯作者，常国斌，E-mail: passioncgb@163.com

S852.4

A

1004-1524(2017)03-0395-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 395-400

http://www.zjnyxb.cn

张莘，郭晓敏，常国斌，等. 鸡NLRC5启动子区转录调控序列的初步研究[J].浙江农业学报，2017，29(3): 395-400.