烟草钾离子通道基因NtTPK的克隆及表达分析

许 力，黄路平，鲁黎明，李立芹

(四川农业大学 农学院，四川 成都 625014)

烟草钾离子通道基因NtTPK的克隆及表达分析

许 力，黄路平，鲁黎明，李立芹*

(四川农业大学 农学院，四川 成都 625014)

采用同源克隆的方法对烟草品种K326中的一个钾离子通道基因NtTPK进行了研究，该基因序列全长1 317 bp，编码438个氨基酸。实时荧光定量PCR结果表明，该基因在茎中的表达量最高；在低钾处理24 h后该基因表达量最低；200 mmol·L-1NaCl处理24 h后该基因表达量最高；在烟草打顶7 d后，该基因在叶和根中的表达量达到最高。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了一定理论基础。

烟草；钾离子通道；NtTPK；生物信息学；基因表达

钾是植物生长发育所必需的大量元素之一，也是一些酶的激活剂，所以它在植物细胞光合作用、蛋白质合成和氧化代谢等一些生理过程中起重要作用[1-2]。K+是植物细胞中含量最丰富的阳离子，但不属于有机结构的组分，在植物中含量很高，可占到植物总干质量的10%左右，新鲜植物组织细胞内的K+浓度高达100～200 mmol·L-1[3-4]。如果植物在生长过程中缺钾则其生长就会受到限制，因为钾缺乏会使依赖K+的酶活性降低，从而导致植物生理代谢紊乱[5]。由此可见，充足的K+对植物生长具有重要意义。烟草是一种需钾量很大的作物，烟叶含钾量是衡量烟叶品质的重要指标之一[6]。钾除了作为重要的营养元素参与烟叶的生理生化反应外，它还可以增加烟叶的燃烧性并因此降低烟制品的焦油含量，从而提高其安全性。但在我国北方烟区的烟叶含钾量大都不足2%[7]，这直接影响到烟叶的产量和品质。

钾转运体/通道是植物生理功能上的重要参与者，包括细胞信号传导、渗透调节、植物营养和金属耐受性[8]。植物从土壤中吸收K+及在体内的转运是通过钾离子通道和钾离子转运体完成的[9]。根据钾离子通道的结构和功能不同可将其分为三大类：Shaker家族通道、TPK/KCO通道和其他钾离子通道[10]。模式植物拟南芥中TPK/KCO通道包括两孔钾离子通道TPK(也称串联孔通道)和一个Kir-型通道。TPK1和TPK4是拟南芥中两孔钾离子通道家族中研究较多的两个成员，TPK1定位在液泡膜上，受Ca2+激活，是选择性K+通道[11]；而TPK4定位在质膜上，不具外向整流特点[12]；信号分子(如细胞内的H+与Ca2+)和物理因素(如温度与压力)可以调节植物两孔钾通道活性[13]。目前烟草TPK/KCO家族中仅NtTPK1和NtTPK2有报道。因此，对钾离子通道TPK/KCO家族成员的研究具有重要理论意义。本研究通过同源克隆的方法从烟草品种K326中成功克隆到NtTPK基因，并对其进行了生物信息学分析，以及分析其组织表达及在低钾、高盐处理下及打顶前后不同时期的表达情况，以期为今后NtTPK的功能研究及其钾营养分子机制提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

植物材料为烟草品种K326，首先进行漂浮育苗，待其生长到十字期，将其移栽到花盆中，每盆种植一株。对打顶前与打顶后烟株的根、叶以及正常生长的根、茎、叶和花进行取样，然后在液氮中速冻，置于-80 ℃冰箱，以供后续试验使用。

将烟草品种K326种子表面消毒后布种于MS培养基上，培养15 d后，将长势一致的幼苗分别转移到低钾(10 μmol·L-1)和高盐(200 mmol·L-1NaCl)的培养基上，处理0、6、12、24 h，然后进行整株取样。低钾培养基是去掉MS培养基中的KNO3，并且用NH4H2PO4代替KH2PO4，其余成分相同。高盐培养基是在MS培养基的基础上添加200 mmol·L-1NaCl。

通用型DNA纯化回收试剂盒购自天根公司，DH5α大肠埃希菌菌株购于Vazyme Biotech公司，cDNA合成试剂盒购于Thermo Scientific公司，Trizol试剂、高保真酶R045A、载体pMD19-T、Prime Script RT reagent Kit、SYBR Green Master mix等试剂均购自大连宝生物公司，引物合成与测序由上海生工完成。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草RNA的提取及cDNA的合成

按照TaKaRa公司的RNA提取用Trizol试剂盒的说明书提取烟草RNA。以RNA为模板，按照cDNA合成试剂盒的操作说明完成cDNA的合成。反转录条件为：42 ℃ 60 min，72 ℃10 min。

1.2.2NtTPK基因的克隆

根据绒毛状烟草两孔钾离子通道基因序列，设计引物NtTPKF和NtTPKR(表1)，扩增反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环。 目的片段纯化后与pMD19-T载体16 ℃连接过夜，连接产物转化大肠埃希菌DH5α 感受态，随后涂在含氨苄青霉素(Ampicillin)的LB 平板上进行筛选，采用菌落PCR 法检测阳性克隆，然后送到生工生物公司进行测序。

1.2.3 目的基因的生物信息学分析

采用ExPASy ProtParam tool与 DNAMAN 软件分析其编码蛋白的分子量、等电点以及其他理化性质，并进行疏水性分析；运用BioEdit，clustalx-2.0.9及MEGA2.0软件构建系统进化树；运用TMHMM Server v. 2.0进行目的基因的跨膜区分析；采用PSORT、NetPhos3.1 Server在线工具、SWISS-MODEL等生物信息学工具对蛋白进行亚定位预测、磷酸化位点及高级结构等的分析。

1.2.4 目的基因的表达分析

根据基因序列，设计目的基因实时荧光定量PCR引物NtTPKqF和NtTPKqR(表1)，采用烟草的18S rRNA作为内参进行基因表达差异研究。PCR扩增程序为：50 ℃反应2 min，95 ℃预变性3 min，然后对95 ℃变性10 s和65 ℃延伸45 s进行39个循环。所有的样品都设置3个重复，反应结束后，基因相对表达水平用2-△△Ct方法进行计算。

2 结果与分析

2.1NtTPK基因的克隆

表1 引物序列

首先提取烟草根总RNA，然后反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，凝胶电泳结果显示获得一条约1 300 bp的特异性条带(图1)。采用凝胶回收试剂盒纯化该条带，然后进行连接并转化大肠埃希菌DH5α，挑取阳性克隆进行测序。

2.2NtTPK基因的组织表达分析

为了检测NtTPK基因在不同组织的表达水平，首先提取烟草根、茎、叶和花的总RNA，根、茎和叶的取样是生长60 d的烟草，而花的取样时期为盛花期，然后通过实时荧光定量PCR实验分析NtTPK基因在根、茎、叶和花的表达量。结果表明，NtTPK基因根、茎、叶和花中均有表达，在茎中的表达量最高，其次是在根中的表达，在花中的表达量最低，在茎中表达量是在根中的3倍(图2)。

2.3 目的基因的生物信息学分析

2.3.1NtTPK编码蛋白的理化性质分析

运用ExPASy ProtParam tool软件对目的基因编码的蛋白进行理化性质在线分析。结果显示，NtTPK蛋白由20种氨基酸构成(其中Leu最多为11.0%，而Trp最少为1.1%)。该预测蛋白的分子量为47.83 ku，分子式为C2188H3423N557O614S20，理论等电点pI为6.60；带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)总数是42，带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)总数是40，消光系数在280 nm时为51 715，NtTPK的脂肪系数为97.49，总的亲水性平均系数为0.099。NtTPK蛋白的不稳定系数是34.26，推测它是一个稳定蛋白。

1，NtTPK基因；M，Marker1， NtTPK PCR product; M， Marker图1 NtTPK基因PCR扩增电泳图Fig.1 Electrophoresis analysis of NtTPK PCR product

图2 不同组织中NtTPK基因的相对表达量分析Fig.2 The relative expression analysis of NtTPK in different tissues

2.3.2NtTPK编码蛋白的跨膜区及疏水性分析

运用TMHMM 2.0对NtTPK编码蛋白的跨膜区进行预测分析，结果显示，NtTPK所编码的蛋白含有5个跨膜区(图3-A)，且在第3个和第4个跨膜区之间均有一个较长的胞质质环。为了进一步分析NtTPK的疏水性，运用DNAMAN软件对其疏水区域进行预测及分析，结果表明，该蛋白含有较多的疏水区域(图3-B)。结合NtTPK的疏水性、总的亲水性平均系数(0.099)以及其他理化性质综合分析，可以说明NtTPK是一个疏水性膜蛋白。

A， 蛋白质跨膜结构分析； B， 蛋白质疏水性分析A， Transmembrane domain analysis of target protein; B， Hydrophobicity analysis of target protein图3 蛋白质跨膜结构与疏水性分析Fig.3 Transmembrane domain and hydrophobicity analyses of target protein

2.3.3 编码蛋白的亚细胞定位及磷酸化位点分析

利用PSORT在线工具预测NtTPK的亚细胞定位，结果显示，NtTPK主要定位在质膜和叶绿体类囊体膜上，在质膜上占0.6，叶绿体类囊体膜上占0.572，在高尔基体上占0.4，在内质网(膜)上占0.3，说明其可能定位在质膜与叶绿体类囊体膜上。利用NetPhos3.1 Server在线工具对NtTPK中的丝氨酸(Serine)激酶、苏氨酸(Threonine)激酶和酪氨酸(Tyrosine)激酶的磷酸化位点进行分析，结果发现NtTPK中含有24个丝氨酸激酶磷酸化位点，9个苏氨酸激酶磷酸化位点和3个酪氨酸激酶磷酸化位点(图4)，推测此蛋白能被激酶磷酸化，从而参与盐胁迫生理过程的调控。

2.3.4 蛋白二级结构及三维结构预测分析

运用IBCP的在线工具SOPMA，对NtTPK的二级结构进行预测，结果显示，α-螺旋为主要结构占46.42%，而β-折叠占7.92%，延伸链占22.64%以及无规则卷曲占23.02%(图5)。运用SWISS-MODEL生物信息学工具对NtTPK蛋白的三维结构进行预测(图6)。

图4 NtTPK中丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸激酶的磷酸化位点分析Fig.4 Predicted phosphorylation site of serine， threonine and tyrosine kinase in NtTPK

图5 蛋白质的二级结构预测Fig.5 Predicted secondary structure of target protein

图6 蛋白质的三维结构预测结果Fig.6 The predicted advanced structure of target protein

2.3.5 NtTPK的序列多重比对及同源性分析

将NtTPK的氨基酸序列在NCBI 数据库中进行BLAST比对，按照相似性程度高低选择19个序列，运用BioEdit，clustalx-2.0.9及MEGA2.0软件构建系统进化树，结果表明，NtTPK与绒毛状烟草两孔钾离子通道TPK3、普通烟草两孔钾离子通道NtTPK3、普通烟草NtTPK1等具有较高的序列同源性(99%、99%、98%)，与胡萝卜两孔钾离子通道TPK3的同源性最低，为81%。根据比对的同源蛋白信息(图7)，将克隆的烟草基因命名为NtTPK。2.4 低钾与高盐处理下NtTPK基因表达模式分析

首先在超净工作台把生长15 d的烟草幼苗转移到低钾与高盐的培养基上处理0、6、12、24 h，然后进行取样提取RNA。通过实时荧光定量PCR实验分析该基因在低钾与高盐处理后的表达模式，结果显示，与对照相比，NtTPK基因随低钾处理时间的延长其表达量呈下降趋势，在处理24 h时，其表达量最低，比对照降低5.1倍(图8)。NtTPK基因随高盐处理时间的延长表达量呈上升趋势，在处理24 h时，其表达量最高，是对照的5.3倍(图8)。

图7 NtTPK与其他植物钾离子通道蛋白的同源性分析Fig.7 Homology analysis of NtTPK and other plant potassium channel protein

2.5NtTPK基因在打顶前与打顶后不同时期的表达分析

本试验通过实时荧光定量PCR实验分析该基因在烟草打顶后(0、1、3、7 d)不同时期叶片和根中的表达量，烟草打顶的时期为现蕾期，结果显示，在烟草打顶1、3和7 d后，叶中该基因表达量逐渐增加。7 d时，其表达量最高。在根中，与对照相比，该基因在打顶后1和3 d的表达量基本一致；但在打顶7 d时，NtTPK基因表达量达到最高水平，是对照的14.6倍(图9)。

图8 低钾与高盐处理下NtTPK基因表达模式分析Fig.8 Analysis of NtTPK gene expression under low potassiumor high salt treatments

图9 打顶前后不同时期叶与根中NtTPK基因的相对表达量分析Fig.9 The relative expression analysis of NtTPK in leaves and roots before and after topping stage

3 讨论

众所周知，钾对烟草生长发育和品质具有重要的影响[14]，在本研究中，首先采用同源克隆的方法获得烟草品种K326中钾离子通道基因NtTPK的全长CDS序列，长度为1 317 bp，编码氨基酸438个，对其跨膜区域预测分析显示，该蛋白具有5个跨膜结构域，这与烟草NtTPK2和胡杨PeTPK1跨膜结构域数目一致[15-16]。蛋白的理化性质及疏水性分析表明，NtTPK可能是疏水性的膜蛋白。亚细胞预测其可能定位在质膜与叶绿体类囊体膜上，这与拟南芥TPK3既定位在质膜也定位在类囊体膜上的双重定位结果一致[17]。磷酸化位点分析说明该蛋白能被一些激酶磷酸化，这些丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化是与一些蛋白(如14-3-3蛋白)相互作用的关键[18]。实时荧光定量PCR实验表明，NtTPK在根、茎、叶和花中均有表达，这与拟南芥AtTPK/KCO和烟草NtTPK2的表达模式是一样的[15，19]，其中该基因在茎中的表达量相对较高，这与NtTPK1基因的表达模式类似[20]。说明NtTPK可能在钾的转运方面具有重要的作用。蔡元保等[21]研究表明，在巴西橡胶树中HbKCO1基因在钾饥饿处理12和24 h时表达量明显下降，在本研究中，NtTPK基因在低钾处理12和24 h后表达量也呈下降趋势，与他们的结果一致。NtTPK基因在高盐处理6、12和24 h后，其表达量呈上升趋势，这与烟草NtTPK1和HbKCO1表达模式类似，这两个基因的表达也是受高盐诱导[20-21]。

在生产上对烟草进行打顶是提高烟叶产量的一项重要栽培措施，但打顶会影响烟叶的K+含量[22]。韩锦峰等[23]研究认为，我国烟叶钾含量低的重要原因是烟草通过根系将K+排到体外，而钾又不能得到充分、适时、合理的补充所造成的。本试验中，通过实时荧光定量PCR实验分析烟草打顶前后不同时期叶和根中NtTPK的基因表达模式，结果表明，在打顶7 d后，NtTPK基因表达量在叶和根中达到最高。代晓燕等[24]研究了烟草品种红花大金元中内流型NKT1与外流型NTORK1钾离子通道基因在打顶后的表达模式，发现在打顶5和24 h后，NKT1基因和NTORK1基因在叶中表达量受到抑制，但是，在打顶1和5 h后这两个基因在根中表达量增加。本研究中的NtTPK与这两个基因在打顶后的表达模式不完全一致，原因可能是烟草品种不同、取样时间不同以及钾离子通道功能不同等。今后进一步研究工作可通过酵母双杂交寻找NtTPK互作蛋白、利用电压钳及转基因技术等明确NtTPK功能。综上所述，本研究结果为下一步研究烟草钾离子通道TPK功能以及了解烟草钾营养的分子机制提供了一定理论基础。

本研究从烟草品种K326中克隆到1个烟草钾离子通道基因，命名为NtTPK。该基因序列全长1 317 bp，编码438个氨基酸。预测其具有5个跨膜结构域，系统进化树分析NtTPK与绒毛状烟草TPK3相似性为99%。NtTPK基因在烟草茎中的表达量最高，低钾处理抑制该基因的表达，而高盐处理24 h后表达量明显上升。在烟草植株打顶7 d后，该基因在叶与根中的表达量达到最高。

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(责任编辑 张 韵)

Cloning and expression analysis of potassium channelNtTPKgene in tobacco

XU Li， HUANG Luping， LU Liming， LI Liqin*

(CollegeofAgronomy，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu625014，China)

A new potassium channel geneNtTPKwas cloned from cultivar K326 using homologous cloning strategy. Sequences analysis showed this gene contained 1 317 bp and coded 438 amino acid residues. Quantitative real-time PCR results showed that the highest expression level of this gene was in the stem; and the lowest expression level emerged after 24 h under low potassium treatment; the gene expression reached its peak level after 24 h under 200 mmol·L-1NaCl treatment; and 7 d after topping， the gene expression showed the highest level in leaves and roots of tobacco. These results provide theoretical bases for further study of the function of potassium channelNtTPKgene.

tobacco; potassium channel;NtTPK; bioinformatics; gene expression

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.03

2016-10-28

植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题(SKLPPBKF 1505, SKLPPBKF 1506)

许力(1992—)，女，四川中江人，硕士研究生，主要从事植物分子生物学研究。E-mail: 892334388@qq.com

*通信作者，李立芹，E-mail: liliqin88@163.com

S572

A

1004-1524(2017)03-0366-07

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 366-372

http://www.zjnyxb.cn

许力，黄路平，鲁黎明，等. 烟草钾离子通道基因NtTPK的克隆及表达分析[J].浙江农业学报，2017，29(3)： 366-372.