小鼠肾集合管发育中的细胞凋亡与整合素α2的表达

田鹤　王雅光　阎丽菁

[摘要]目的觀察小鼠肾集合管发育过程中细胞凋亡与整合素α2的表达，探讨小鼠集合管发育过程中整合素α2及细胞凋亡的作用。方法应用免疫组织化学及灰度值测量、TUNEL染色及细胞凋亡指数检测方法对胚龄（E）17、18d及生后日龄（P）1、3、7、14、21、40d的小鼠肾集合管中整合素α2的表达和细胞凋亡情况进行观察分析。结果整合素α2于E17d的集合管开始出现，至P7d达到高峰，之后无明显含量的变化。TUNEL染色显示细胞凋亡最早出现于Pld的集合管，PTd达到最高峰，之后无明显变化。结论整合素α2及细胞凋亡对集合管的发育过程起一定的作用，整合素α2对细胞凋亡有一定的影响作用。

[关键词]整合素α2；细胞凋亡；集合管；肾发育；小鼠

[中图分类号]R692

[文献标志码]A

[文章编号]2095-0616（2016）23-38-03

整合素（integrin）是细胞粘附分子的一种，在肾脏有20余种整合素的表达。整合素α2是一种表达在肾小管和集合管上皮细胞中的整合素，对肾小管上皮细胞的分化及细胞与细胞外基质的粘附起一定的作用。细胞凋亡也称作程序性细胞死亡，是特殊的细胞死亡过程，由基因调控，发生机制十分复杂。发育生物学相关研究证实肾脏等机体器官的发生发育过程中包含着细胞凋亡，且有着较为严格的时空顺序。研究发现整合素α2能够促使肿瘤细胞表达凋亡相关蛋白，整合素相关的钙离子的内流，磷酸化的发生等与细胞凋亡的激发有密切的关系。目前，关于肾发育过程中细胞凋亡与整合素时空性表达的关系尚未见报道。本研究通过免疫组织化学、细胞灰度值测量、TUNEL染色和细胞凋亡指数测定观察分析整合素α2在小鼠肾脏集合管发育过程中的表达变化和细胞凋亡情况，探讨在肾集合管发育过程中整合素α2和细胞凋亡的作用及相互关系。

1.资料和方法

1.1一般资料

2015年6月～2016年6月期间由锦州医科大学生命科学研究院动物部提供健康的昆明小鼠，2月龄，雌雄各半，体重25～30g。小鼠雌雄1：1同窝饲养，以观察阴道栓脱落的方式确定雌鼠受孕时间，将阴道栓脱落的最早时间记为胚龄（embryonicdays，E）0d。以观察到仔鼠出生的最早时间记为生后（postnatal days，P）0d。选取胚龄17、18d的胎鼠和生后1、3、7、14、21、40d的仔鼠，每组5只。兔抗小鼠整合素α2抗体购自Abcam公司，sP免疫组化试剂盒购自福建迈新公司，TUNEL试剂盒购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1标本制备10%水合氯醛（100g/L）麻醉孕鼠，剖腹取胎鼠，胚龄17、18d的胎鼠后壁剖开取全肾，生后1、3、7、14、21、40d的仔鼠取出肾脏后切成小块固定。肾脏标本放入4%多聚甲醛中固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，切5um厚度的切片，用于免疫组织化学染色和TUNEL染色。

1.2.2免疫组织化学染色及灰度值测量石蜡切片常规免疫组织化学染色检测整合素α2在不同发育阶段小鼠肾组织集合管中的表达变化，阳性反应产物呈棕黄色。用细胞图像分析系统对阳性反应切片进行图像分析，以灰度值来表示整合素α2蛋白的表达量，灰度值越大表示整合素α2的含量越少，染色越浅。以切片背景色为参照，对集合管进行分析。每个日龄动物选取5个组织块，每个组织块选取5张切片，每张切片系统随机取5个阳性视野，在400倍光镜下分析。

1.2.3TUNEL染色及细胞凋亡指数检测石蜡切片脱蜡至水，滴加蛋白酶K室温孵育15min，滴加TUNEL混合溶液37℃孵育1h，冲洗，滴加转化剂-POD 37°C孵育30min，冲洗，DAB显色，镜下观察，随时终止。苏木精染色细胞核5min，脱水透明，树胶封片。TUNEL阳性染色定位于细胞核内，呈不同程度棕黄色。每一日龄小鼠肾脏标本取5张切片，每张切片随机选取5个集合管，在细胞图像分析仪上记数TUNEL阳性细胞数量和集合管总细胞数，计算凋亡指数AIfApoptosis Index，AI=TUNEL阳性细胞数/细胞总数。

1.3统计学处理

统计分析用SPSSl9.0软件完成，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以百分比表示，采用X²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1免疫组化染色灰度值测量结果

对整合素α2免疫组织化学染色阳性切片进行灰度值测量，经过统计分析得到结果如下：胚龄17d，小鼠肾脏中出现集合管，此时可见整合素α2微弱表达，灰度值较强，随后，在胚龄18d以及生后1、3、7d的集合管中，整合素α2的表达强度逐渐增强，灰度值逐渐减小。生后7d，整合素α2的表达达到顶峰后，表达量趋于稳定。见表1。

2.2TUNEL染色及细胞凋亡指数检测结果

TUNEL染色阳性的细胞为凋亡细胞，计数小鼠肾集合管中凋亡细胞和总细胞数，统计凋亡指数。生后1d，集合管细胞开始出现凋亡现象，细胞凋亡指数为（33.46±3.59）%，生后7d凋亡达到高峰，凋

3.讨论

细胞凋亡是1972年由Kerr首先提出的一种细胞自我消亡的形式，是基因控制的一种生理性细胞死亡。在一些组织和较为精细器官的发育过程中，细胞凋亡有控制细胞数量，去除多余和异常细胞的作用。TUNEL是目前比较常用的检测细胞凋亡的形态学手段，本研究也应用TUNEL染色观察小鼠肾集合管发育过程中的细胞凋亡情况，并进行了凋亡指数的计算。结果显示，在生后1d小鼠肾脏集合管中可见TUNEL阳性细胞，至生后7d阳性细胞数量最多，凋亡指数最高，随后至生后40d，细胞凋亡无明显变化。这些结果说明生后1～7d是集合管发育的主要阶段，尽管此时细胞数量已够，但可能还需要通过凋亡来清除因增生而过剩的细胞，凋亡有利于管腔的形成，也可以调控集合管的发育速度。生后7～40d，集合管细胞不再分支，进入到发育完善时期，以生长和成熟为主。

同时本研究也应用免疫组织化学方法结合细胞图像分析技术观察了整合素α2在集合管发育过程中的表达变化，结果显示在胚龄17d的刚发生的集合管中即出现整合素α2的阳性细胞，表达在集合管上皮细胞的胞浆内和膜上，至生后7d表达量达到顶峰，随后表达强度无明显改变。这些研究结果表明在小鼠肾集合管发育过程中，细胞凋亡与整合素α2有一定的相关性。集合管发育早期，整合素α2可能影响上皮细胞的分化，影响集合管的分支形态发生。生后1～7d是集合管快速发育的时期，整合素α2也在这一时期有含量上的明显变化，与细胞凋亡同时在生后7d达到高峰，这表明整合素α2可能介导集合管发育过程中的细胞凋亡，具体的影响机制还有待于进一步的研究。