巴弗洛霉素A1对脑缺血再灌注损伤作用的初步研究

王志坚，刘胜兵，沈忠飞

（嘉兴学院医学院，浙江嘉兴314000）

巴弗洛霉素A1对脑缺血再灌注损伤作用的初步研究

王志坚，刘胜兵，沈忠飞

（嘉兴学院医学院，浙江嘉兴314000）

目的：探讨预防性给予SD大鼠巴弗洛霉素A（Bafilomycin A1,Baf A1）对局部脑缺血再灌注损伤(middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO/R），是否神经保护作用及初步机制研究.方法：健康雄性SD大鼠80只，随机分为：假手术组（sham）、对照组（Saline）、氟西汀组（Fluo）和Baf A1组.Fluo组和Baf A1组大鼠于术前分别给予氟西汀混悬液(2.0mg-1kg-1d-1)灌胃和Baf A1(1.0mg-1kg-1d-1)，连续14d；sham组和Saline组均于术前14天开始给予等体积生理盐水.再灌注24h后，进行神经神经功能相关检测，并用TTC染色法计算脑梗死面积，并提取新鲜脑组织总蛋白采用Western blot检测自噬相关蛋白Beclin 1的表达.结果：Baf A1可显著降低大鼠脑缺血再灌注后神经功能损伤症状，减少脑梗死面积，并降低自噬相关蛋白Beclin 1的表达.结论：Baf A1对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用，可能是通过降低自噬性死亡实现的.

Bafilomycin A1；脑缺血再灌注损伤（MCAO/R）；自噬；Beclin 1

脑缺血再灌注损伤是脑组织缺血后再次获得血液供应时引发的继发性神经结构和功能损伤，主要与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等有关[1,2].而近期研究表明，在脑缺血、炎症反应等应激状态下，神经元内Beclin1、LC3-Ⅱ等自噬相关蛋白表达增加，自噬溶酶体途径被激活且参与了脑缺血再灌注损伤[3].研究表明，Baf A1对神经功能损伤具有保护作用[4]，但其在脑缺血再灌注损伤中是否起到保护作用还未见报道，本实验通过观察Baf A1对脑缺血再灌注损伤的保护作用，通过检测自噬相关蛋白Beclin 1的表达，探究其对自噬的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤中的作用机制.

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SD大鼠，体重280-300g（浙江大学实验动物中心提供）,随机分为sham组、Saline组、Fluo组和Baf A1组，每组各20只.

1.2 大鼠脑缺血再灌注损伤模型制备

采用改良longa．Zea氏线栓法[5]制备大鼠MCA闭塞的脑缺血再灌注模型.大鼠以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，背位固定，备皮，消毒，行颈部正中切口，逐层分离组织，暴露左侧颈内动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎CCA近端、ECA根部，于ICA处备线打一活结.在左侧ICA近颅端夹一微动脉夹，CCA结扎处远端剪一斜口，经此插入备好的线栓，并将其缓慢经ICA入颅至大脑前动脉(anterior cerebral artery，ACA)以阻断MCA的血流.结束后立即结扎并缝合皮下组织和皮肤，酒精消毒.再灌注24h处死动物.假手术组只分离、暴露血管，不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插栓线，余同以上两组.

1.3 神经功能评分及大鼠脑梗死面积检测

采用改良Bederson评分法进行神经功能缺损评分[6].后快速断头取脑.把脑组织迅速放入-20℃冰箱冷冻，切成2mm的冠状切片浸入1%TTC溶液，37℃水浴锅30分钟，拍照，正常组织呈鲜红色，梗死组织为白色，计算出梗死体积占大脑体积的百分比.

1.4 Western blot检测

收集大鼠损伤侧海马组织，提取组织总蛋白，进行SDS-PAGE电泳.条件为电压80V跑30min后换110V 70min、凝胶浓度12%和5%.转膜后于5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入抗Beclin 1(1:1000)一抗孵育过夜，，洗膜后加入辣根过氧化物标记的二抗(抗兔IgG，HRP，1：1000),显影定影后用Image J分析蛋白相对表达量.

1.5 统计学处理

所有实验均重复3次以上，数据采用GraphPad Prism5. 0处理.结果以均数±标准差（mean±SD）表示，各组间计量资料的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），用SNK-q检验法进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 神经功能评分

按照改良Bederson评分法，统计结果显示（图1）：再灌注24h后，Saline组评分较sham组显著升高，提示脑缺血再灌注后神经功能明显受损.而Fluo组与Baf A1组评分明显低于Saline组，Fluo组与Baf A1组无明显差异，提示BafA1明显降低脑缺血再灌注后的神经功能损伤.

图1 缺血再灌注24h后神经功能评分

2.2 脑梗死体积检测

由图2可知，sham组大鼠脑组织未形成明显梗死灶；Saline组梗死体积明显高于sham组，可见脑缺血再灌注后出现明显的大脑梗死.而Fluo组与Baf A1组明显低于Saline组，Fluo组与Baf A1组无明显差异，因此，Baf A1作用后明显降低大鼠缺血再灌注后的大脑梗死体积.

图2 缺血再灌注24h后脑梗死体积比

2.3 自噬相关蛋白Beclin 1表达水平检测

免疫印迹结果（图3），Saline组海马区Beclin 1表达与sham组相比明显增加，而Fluo组与Baf A1组较Saline组明显降低，差异具有统计学意义，Fluo组与Baf A1组无明显差异.

图3 缺血再灌注24h后自噬相关蛋白的表达

3 讨论

Baf A1是一种来源于灰色链霉素的大环内酯类抗生素，常通过抑制H+-ATP酶质子泵抑制后期自噬[7]，并抑制肿瘤细胞生长和增殖[8].研究表明，Baf A1对神经功能损伤具有保护作用，但其在脑缺血再灌注损伤中是否起到保护作用还未见报道.

本实验通过预防性的应用Baf A1观测其对脑神经的保护作用，结果显示，与Saline组相比，Baf A1组大鼠神经功能缺失显著降低，表明Baf A1可明显改善脑缺血再灌注损伤后大鼠的神经功能缺损，发挥保护神经的作用.同时，本实验还采用了TTC染色法观察梗死体积，与Saline组相比，Baf A1组脑缺血再灌注损伤的脑梗死体积明显缩小，进一步表明Baf A1对脑缺血再灌注损伤具有保护作用.

目前关于脑缺血再灌注中的自噬调控作用和机制尚没有一致的说法或解释.有一部分学者认为，药物作用激活细胞自噬可以缓解或者减少再灌注后脑的梗死体积，简言之，激活细胞自噬可以对脑缺血再灌注产生保护作用[9].Beclin 1是自噬起始的关键调控基因之一，其表达的多少可以反映自噬水平的高低.我们发现，Baf A1预处理，自噬相关蛋白Beclin 1表达下调，说明Baf A1可能通过抑制前期和后期自噬对大脑功能发挥保护作用.

综上，Baf A1可明显减轻脑缺血再灌注损伤，保护大脑功能，通过抑制细胞自噬可能是作用机制之一，但是具体的作用机制还有待于进一步的研究.

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〔4〕伏春艳，王志坚，沈忠飞，等.巴弗洛霉素A对抑郁大鼠行为及海马脑源性神经营养因子的影响.四川大学学报（医学版），2017（48）:50-53.

〔5〕LongaEZ，PR，CarlsonS．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy．in rats．Stroke，1989; 20：84-89

〔6〕Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination.Stroke，1986;17：472-476.

〔7〕Mauvezin C,Neufeld TP.Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusio.Autophagy.2015;11:1437-8.

〔8〕Yuan N,Song L,Zhang SP,Lin WW,Cao Y,Xu F,Fang YX,Wang Z,Zhang H,Li X,Wang ZJ,Cai JY,Wang J, Zhang Y,Mao XL,Zhao WL,Hu SY,Chen SN,Wang JR.Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica.2015;100:345-56.

〔9〕Zhao G,Zhang W,Li L Pinocembrin Protects the Brain against Ischemia-Reperfusion Injury and Reverses the Autophagy Dysfunction in the Penumbra Area. Molecules.2014,19(10):15786-98.

R651

：A

：1673-260X（2017）03-0042-02

2016-11-24

浙江省实验动物科技计划项目（2014C37019）；嘉兴市科技局项目（2015AY23066）；嘉兴学院校SRT计划项目（SRT2016C097）

王志坚，女，汉，1987-07，硕士，嘉兴学院实验师，研究方向：脑缺血再灌注损伤