2种羊巴贝斯虫的核型及系统发育分析

许艳起，张浩浩，杨 强，李超昆，牛怡倩，张改平，马润林*，关贵全

(1.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100； 2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；3.中国科学院 遗传与发育生物学研究所/分子发育生物学国家重点实验室，北京 100101； 4.中国农业科学院 兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州 730046； 5.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

2种羊巴贝斯虫的核型及系统发育分析

许艳起1,2,3,4，张浩浩3,4，杨 强3,4，李超昆3，牛怡倩3，张改平1,2,5*，马润林3*，关贵全4*

(1.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100； 2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；3.中国科学院 遗传与发育生物学研究所/分子发育生物学国家重点实验室，北京 100101； 4.中国农业科学院 兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州 730046； 5.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

为明确引起羊巴贝斯虫病的病原虫莫氏巴贝斯虫临潭株(BabesiamotasiLintan,BLT)及羊巴贝斯虫未定种新疆株(Babesiasp.Xinjiang,BXJ)的核型和亲缘关系，通过DNA大片段脉冲场凝胶电泳(PFGE)和三代高通量测序对2种虫体进行核型分析和系统发育分析。结果表明：2 种巴贝斯虫都有4 条染色体，但基因组的大小与核型分析不一致，莫氏巴贝斯虫临潭株基因组大小为11.1 Mb，4 条染色体大小分别为6.0 Mb、3.0 Mb、1.1 Mb和1.0 Mb；羊巴贝斯虫未定种新疆株基因组大小为7.0 Mb，4 条染色体分别为2.4 Mb、2.0 Mb、1.7 Mb和0.9 Mb；羊巴贝斯虫未定种新疆株与牛巴贝斯虫的亲缘性较近，而莫氏巴贝斯虫临潭株与双芽巴贝斯虫的亲缘关系较近。

莫氏巴贝斯虫； 羊巴贝斯虫未定种； 染色体； 核型分析； 系统发育分析

巴贝斯虫病是由病原巴贝斯虫通过蜱传播的血液原虫病，病原寄生于牛、羊、马、犬等动物的红细胞中，可引起多种脊椎动物发病。该病广泛分布于温带、热带及亚热带地区，其危害仅次于锥虫病，在世界范围内对养殖业造成了严重的影响[1-4]，临床表现出发热、溶血性贫血、黄疸、消瘦、衰弱、血红蛋白尿(驽巴贝斯虫除外)等症状[5-10]。

自巴贝斯虫病被发现以来，研究人员从其致病机制、入侵机制、代谢途径、流行病学、病原特点等多方面开展了深入的研究，但在基因水平上的研究较少。随着分子生物学技术的发展，特别是高通量测序技术的出现，为该病的研究打开了契机，不少研究者从基因水平上开展了大量工作，主要集中于对牛巴贝斯虫(B.bovis)、犬巴贝斯虫、田鼠巴贝斯虫(B.microti)的研究。Jones等[11]利用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)及端粒探针杂交技术对牛巴贝斯虫染色体进行研究发现，牛巴贝斯虫有4 条单倍体基因组；Depoix等[12]用PFGE技术对犬巴贝斯虫B.canis(欧洲种)和B.rossi(南非种)染色体进行研究发现,B.canis和B.rossi单倍体基因组各由5条染色体组成；Brayton等[13]利用鸟枪法对牛巴贝斯虫T2Bo株进行了全基因组测序，通过拼接组装得到牛巴贝斯虫的4 条染色体；Cornillot等[14]发表了田鼠巴贝斯虫基因组序列数据。但目前未曾见到在基因组水平上对羊巴贝斯虫研究的相关报道。

羊巴贝斯虫病在我国甘肃、青海和四川等西部地区均有发生，对我国养羊业的持续发展造成了严重的阻碍。羊巴贝斯虫主要有莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种2 种，莫氏巴贝斯虫专一性感染羊，在自然条件下有病例发生，通过血涂片可以检测到虫体，而羊巴贝斯虫未定种在自然条件下无病例发生，通过血涂片检测不到虫体，但使用分子检测技术可以检测到病原[15-17]。为了研究2 种虫原的致病性差异，从根本上了解2 种虫原入侵机制、代谢途径及致病机制，兰州兽医研究所于2010年开始开展了2 种羊巴贝斯虫的基因组研究工作，对2 种虫原进行了二代基因组测序及基因组细菌人工染色体文库(BAC)的构建，并初步搭建了10 条羊巴贝斯虫未定种新疆株框架，但没有构建莫氏巴贝斯虫物理图谱[18]。为此，以羊巴贝斯虫未定种新疆株单克隆系G5及莫氏巴贝斯虫临潭株单克隆系G7为研究对象，通过核型分析获得二者的染色体条数和大小，然后进行三代高通量测序，利用测序结果进行系统发育分析，找到与其亲缘关系较近的物种，为构建这2 种巴贝斯虫精确的基因组序列图谱奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试虫原

供试羊巴贝斯虫未定种新疆株(BXJ)单克隆系G5及莫氏巴贝斯虫临潭株(BLT)单克隆系G7由兰州兽医研究所寄生虫病研究室提供。

1.2 虫体的纯化

参考Guan等[19]报道的巴贝斯虫体外培养系，在体外红细胞培养羊巴贝斯虫未定种新疆株单克隆系G5及莫氏巴贝斯虫临潭株单克隆系G7。用体外培养系获得的培养物感染除蜱羊(兰州兽医研究所提供)，当除蜱羊染虫率达到10%以上，颈静脉采集抗凝血。过滤、离心去除白细胞，经裂解红细胞及差速离心等方法纯化获得2株巴贝斯虫红细胞阶段的裂殖子，-70 ℃保存备用。

1.3 虫体的包埋与消化

分别取纯化的莫氏巴贝斯虫临潭株及羊巴贝斯虫未定种新疆株红细胞阶段的裂殖子各500 mL，并用Tris-NaCl(pH值7.4)将巴贝斯虫裂殖子稀释到1.0×108个/mL左右。将裂殖子与1%的低熔点琼脂糖凝胶在45 ℃水浴锅中预热5 min,在45 ℃水浴锅中等体积混合并孵育5 min，期间轻轻连续吹打。然后将混合液转移至用75%乙醇清洗过的冰模上，冰上放置15 min。将凝固的包埋块置于100倍体积的裂解液(0.5 mol/L EDTA,pH值9.0,1% 十二杂基肌酸杂氨,1 mg/mL蛋白酶K)中，然后在分子杂交炉中50 ℃消化24 h，更换1次裂解液，相同条件下再消化24 h。取出低熔点琼脂糖包埋块分别用20倍体积的含0.1 mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)和不含苯甲基磺酰氟的TE Buffer在冰上分别浸洗3次，每次1 h；最后将经过预处理的包埋块置于0.05 mol/L EDTA(pH值8.0)中，4 ℃保存备用[20-21]。

1.4 DNA完整性检测

将经过预处理4 ℃保存的2种巴贝斯虫裂殖子低熔点琼脂糖包埋块各取1块，分成1/2块、1/4块、1/8块，置于1%的琼脂糖凝胶中，进行脉冲场凝胶电泳分析，检测巴贝斯虫裂殖子基因组中DNA的降解程度。

脉冲场凝胶电泳条件：琼脂糖凝胶浓度1%；电泳缓冲液：1×TAE；温度：12.5 ℃；泵速：1 L/min；电场夹角：120°；起始脉冲时间：0.1 s；终止脉冲时间:40 s；电场强度：6 V/cm；电泳时间：16 h。

1.5 核型分析

将2 种经过处理的巴贝斯虫基因组低熔点琼脂糖包埋块各取1块，置于0.8%的琼脂糖凝胶胶孔中，尽量排尽胶孔中的气泡，且使包埋块均匀填于胶孔中，然后再用0.8%的琼脂糖凝胶封闭胶孔。进行脉冲场凝胶电泳，对2株巴贝斯虫的染色体进行分析。

脉冲场凝胶电泳条件：电泳缓冲液：1×TAE缓冲液；电泳温度：14 ℃；泵速: 1 L/min；起始脉冲时间:500 s；终止脉冲时间：500 s；电场夹角：106°；电场强度：3 V/cm；电泳时间：48 h。

1.6 系统发育分析

将纯化的裂殖子阶段的虫体送武汉未来组生物科技有限公司，利用Pacbio三代高通量测序技术测定全基因组序列。将得到的2 种巴贝斯虫全基因组数据与已经发表的双芽巴贝斯虫(B.bigemina)[22]、牛巴贝斯虫(B.bovis)[23]、田鼠巴贝斯虫(B.microti)[14]、牛环形泰勒虫(T.annulata)[24]、马泰勒虫(T.equi)[25]、牛环形东方泰勒虫(T.orientalis)[26]、小泰勒虫(T.parva)[27]、微小隐孢子虫(C.parvum)[28]、弓形虫(T.gondii)[29]和恶性疟原虫(P.falciparum)[30]的基因组数据进行基因家族聚类，得到物种之间保守的单拷贝基因家族。使用 782 个单拷贝基因家族的蛋白质序列，利用 Mafft软件比对[31]，将蛋白质序列比对转换成 CDS 序列比对，使用 Gblocks软件进行过滤，得到CDS 文件[32]。最后采用RAx ML方法构建系统发育树[33]，采用 GTRGAMMA模型，Bootstrap 设置为 100，以恶性疟原虫为外群物种。

2 结果与分析

2.1 包埋块中DNA的完整性检测

DNA降解片段和核酸多糖等杂质会在核型分析中出现多余条带，直接影响核型分析的准确性。图1为2 种巴贝斯虫基因组包埋块脉冲场凝胶电泳的DNA的完整性检测结果。检测结果均为单一明亮条带，且无小片段DNA及杂质干扰。说明基因组包埋块中DNA的降解较少，且杂质处理比较干净，可以用于下一步的染色体核型分析。

A：莫氏巴贝斯虫临潭株；B：羊巴贝斯虫未定种新疆株；M：New England Biolabs 脉冲场凝胶电泳分子质量标准；1：1/2基因组包埋块；2：1/4基因组包埋块；3：1/8基因组包埋块

2.2 核型分析

核型分析是研究物种进化、分类及染色体结构的重要手段。从图2可以看出，莫氏巴贝斯虫临潭株和羊巴贝斯虫未定种新疆株均有4 条染色体，但染色体大小有明显的不同。莫氏巴贝斯虫临潭株4 条染色体，其大小分别为6.0 Mb、3.0 Mb、1.1 Mb和1.0 Mb；羊巴贝斯虫未定种新疆株的4 条染色体，其大小分别为2.4 Mb、2.0 Mb、1.7 Mb和0.9 Mb。测序结果显示，莫氏巴贝斯虫临潭株的基因组大小约为11.1 Mb，羊巴贝斯虫未定种新疆株的基因组大小约为7.0 Mb。

A：羊巴贝斯虫未定种新疆株；B：莫氏巴贝斯虫临潭株

2.3 系统发育分析

在物种进化过程中，由于单拷贝基因始终保持只有1个拷贝，所以该类基因在不同物种间是非常保守的，可以用于系统发育分析。通过单拷贝基因比对，得到莫氏巴贝斯虫临潭株、 羊巴贝斯虫未定种新疆株与双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、田鼠巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、马泰勒虫、牛环形东方泰勒虫、小泰勒虫、微小隐孢子虫、弓形虫、恶性疟原虫的系统发育关系(图3)。由图3可以看出，羊巴贝斯虫未定种新疆株与牛巴贝斯虫的亲缘性较近，而莫氏巴贝斯虫临潭株与双芽巴贝斯虫有较近的亲缘关系。

每个分支长度代表进化速率，分枝上数值代表 Bootstrap 支持数

3 结论与讨论

迄今为止，全世界报道的巴贝斯虫有100多种，在世界范围内广泛分布。国内学者对巴贝斯虫病的病原特性、传播媒介、流行病学、入侵机制等方面做了很多研究，但是这些研究大多是基于表型分析入手，寻找已知功能的编码基因，仅仅了解巴贝斯虫的极少数的基因。而从基因组水平上对巴贝斯虫的全基因进行核苷酸测序，在了解全基因的结构基础上研究各个基因单独或数个基因间相互作用的功能还很少。为了从基因组水平上对我国广泛分布的2 种羊巴贝斯虫进行相关研究，中国农业科学院兰州兽医研究所于2010年启动羊巴贝斯虫未定种新疆株及莫氏巴贝斯虫临潭株基因组二代测序工作，测序结果显示，羊巴贝斯虫未定种新疆株的基因组大小约为7.8 Mb，与现已报道的其他梨形虫的基因组大小基本一致；而莫氏巴贝斯虫临潭株测定的基因组大小约为17.6 Mb，远远大于现已报道的梨形虫的基因组[18]。与本研究进行的大片段脉冲场凝胶电泳核型分析估测的结果(羊巴贝斯虫未定种新疆株基因组大小7.0 Mb 和莫氏巴贝斯虫临潭株基因组大小11.1 Mb)相差比较大，并且测序拼接数据也不理想。

随着三代高通量测序技术的出现及成熟，2015年又进行了三代高通量测序，测序结果显示，羊巴贝斯虫未定种新疆株有7条Scaffold，测序深度达到187.85 X，总碱基为8.5 Mb；莫氏巴贝斯虫临潭株有12条Scaffold，总碱基达到14 Mb，深度达到154.78 X[18]。三代高通量测序拼接数据更接近于2 种虫原的染色体条数，同时三代测序结果与脉冲场凝胶电泳核型分析得到的数据也更加相近。虽然通过这2 种方法获得的2 种巴贝斯虫基因组的数据大小依然存在一定的差异，这可能是由于2 种方法本身的差异造成。虽然二者基因组的大小还需要做进一步的验证，但2种方法来源的数据均可以表明，这2种巴贝斯虫的基因组大小确实不同，而且初步确认这2 种巴贝斯虫都具有 4 条染色体。通过对得到的2 种虫原的单拷贝基因进行系统发育分析，得到2株巴贝斯虫与牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的亲缘性较近，而目前关于牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的研究较深入，这为后续对莫氏巴贝斯虫及羊巴贝斯虫未定种相关的研究奠定一定的基础。

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Karyotyping and Phylogeny of Two OvineBabesiaSpecies in China

XU Yanqi1,2,3,4，ZHANG Haohao3,4，YANG Qiang3,4，LI Chaokun3，NIU Yiqian3，ZHANG Gaiping1,2,5*，MA Runlin3*,GUAN Guiquan4*

(1.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.State Key Laboratory for Molecular Developmental Biology,Institute of Genetics and Developmental Biology/Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China; 4.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province/Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Lanzhou 730046, China; 5.College of Veterinary Medicine and Animal Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to make sure karyotype and genetic relationship ofBabesiamotasiLintan(BLT) andBabesiasp.Xinjiang(BXJ),the karyotype analysis and phylogenetic analysis were performed by pulsed field gel electrophoresis(PFGE) and 3 generation high-throughput sequencing.The results showed that both of them had 4 chromosomes.But the size of the genome was not consistent with karyotype analysis.Genome size of BLT was 11.1 Mb,and each chromosome size was 6.0 Mb,3.0 Mb,1.1 Mb and 1.0 Mb.Genome size of BXJ was 7.0 Mb with 4 chromosomes of 2.4 Mb,2.0 Mb,1.7 Mb and 0.9 Mb.Besides,phylogeny of the 2 parasites was analyzed on the basis of genomic data sequenced using third generation sequencing technique.Results indicated that BXJ had close genetic relationship withB.boviswhile BLT was more related withB.bigemina.

Babesiamotasi;Babesiasp.; chromosome; karyotyping; phylogeney

2016-08-30

家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放课题(2015-MDB-05)

许艳起(1988-),女，河南周口人，在读硕士研究生，研究方向：分子病原学与免疫学。 E-mail:xuyanqi0123@163.com

*通讯作者：张改平(1960-)，男，河南内黄人，研究员，博士，主要从事动物免疫学及重大疫病快速检测技术研究。 E-mail:zhanggaiping2003@163.com 马润林(1958-)，男，甘肃成县人，研究员，博士，主要从事人类及动物功能基因组学研究。 E-mail:rlm@genetics.ac.cn 关贵全(1974-)，男，甘肃武山人，研究员，博士，主要从事动物寄生虫及其分子生物学研究。 E-mail：guanguiquan@caas.cn

S852.69

A

1004-3268(2017)03-0138-05