广西地不容内生真菌DBR-12和DBR-23代谢产物的抑菌活性

刘晓莹，孙文斌，陈洁萍，卿 朕，周秋艳，邓业成

(广西师范大学 生命科学学院/珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室，广西 桂林 541004)

广西地不容内生真菌DBR-12和DBR-23代谢产物的抑菌活性

刘晓莹，孙文斌，陈洁萍，卿 朕，周秋艳，邓业成*

(广西师范大学 生命科学学院/珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室，广西 桂林 541004)

研究从广西地不容块根中分离出的DBR-12和DBR-23两株内生真菌的抑菌活性，为其在抗菌剂领域的开发利用提供依据。首先用液体培养基对内生真菌进行发酵培养，采用两相溶剂液液萃取法对发酵产物进行初步分离，然后用菌丝生长速率法和带毒平板法分别测定发酵产物对10种植物病原真菌和15种动物致病菌的抑菌活性。结果表明，DBR-12和DBR-23发酵产物乙酸乙酯萃取物对植物病原真菌均有较好的抑菌活性。DBR-12对玉米小斑病菌等6种病原真菌的抑制效果较好，有效中浓度(EC50)为0.010 4～0.079 7 g/L，其中对玉米大斑病菌的毒力最高；DBR-23对除玉米小斑病菌外的9种病原真菌抑制效果较好，EC50为0.020 6～0.174 6 g/L，其中对甘蔗凤梨病菌的毒力最高。DBR-12发酵产物正丁醇萃取物对玉米大斑病菌等5种植物病原真菌的抑制效果较好，EC50为0.107 8～0.646 9 g/L，其中对金橘砂皮病菌的毒力最高。DBR-23发酵产物乙酸乙酯萃取物对痢疾志贺氏菌等12种动物致病菌有抑菌活性，最低抑菌浓度(MIC)为1～2 g/L；DBR-12发酵产物对动物病原菌无抑菌活性。综上，广西地不容内生真菌DBR-12和DBR-23有较好的抑菌活性，在抗菌剂领域有较好的开发应用前景。

广西地不容； 内生真菌； 代谢产物； 抑菌活性

植物内生菌(endophyte)是指那些在其生活史中一定阶段或全部阶段生活在活的植物组织内，不引起植物组织产生明显病害症状的真菌或细菌[1-2]。在内生菌与宿主植物长期协同进化过程中，由于内生菌与植物间基因交换的结果，使内生菌能够产生与其宿主植物相同或相似的化学成分，而且植物内生菌产生的化合物结构类型已远超出其植物代谢产物的范围[3-4]。内生菌丰富的次生代谢产物中存在大量的抗肿瘤、抗菌、抗炎和杀虫等活性物质[5-7]，故其对细菌和真菌有抑制效果，是发现新天然活性物质的重要资源库，为天然药物和无公害农药的开发开辟了新的途径，具有重要的研究价值。广西地不容(StephaniakwangsiensisLo.)属防己科千金藤属多年生草质落叶藤本植物[8]，主要分布于广西西北部和西南部，生长于石灰岩的石山地区，是广西壮族等少数民族常用的草药。广西地不容块根含生物碱3%～4%，具有很强的镇痛、抗炎、抑菌作用[9-10]。研究表明，生物碱还具有杀虫、抗糖尿病等广泛的生理活性[11-12]。广西地不容的生长受土壤与气候的限制而分布范围窄，因此，从中分离出特殊内生真菌，并从内生真菌代谢产物中发现新的生物活性物质的可能性大。目前，国内外对广西地不容内生真菌的研究很少，因此，该植物的内生真菌资源未能得到充分开发和利用。研究广西地不容内生真菌代谢产物的生物活性，对促进其开发利用具有重要意义。现已从广西地不容块根中分离出了多株内生真菌，前人仅研究了其中3株内生真菌代谢产物的抑菌活性[13-14]，其他内生真菌代谢产物的抑菌活性有待继续探究。为此，研究从广西地不容块根中分离出的DBR-12和DBR-23两株内生真菌代谢产物的抑菌活性，旨在探究代谢产物抑菌活性效果更好的内生真菌，为其在抗菌剂领域的开发利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试植物内生真菌：DBR-12和DBR-23均从采自广西植物研究所的广西地不容块根中分离获得。

供试植物病原真菌有10种：玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、金橘砂皮病菌(Diaporthecitri)、贡柑链格孢菌(Alternariacitri)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、甘蓝黑斑病菌(Alternariaoleracea)、烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)、茶轮斑病菌(Pestalotiopsistheae)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、水稻胡麻叶斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)、甘蔗凤梨病菌(Ceratocystisparadoxa)。其中，金橘砂皮病菌和贡柑链格孢菌由广西特色作物研究所提供，其余由广西大学农学院植物病理室提供。

供试动物病原菌有15种：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、普通变形杆菌(Proteusbacillusvulgaris)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、炭疽杆菌(Bacillusanthraci)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、乙型副伤寒杆菌(BacteriumparatyphosumB)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)。所有动物病原菌均由桂林医学院微生物实验室提供。

对照药物：百菌清(chlorothalonil)原药由利民化工股份有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的发酵 在PDA平板上接种纯化保存的DBR-12和DBR-23菌种，待其生长旺盛后，用直径为0.4 cm的无菌打孔器在菌落平板上切取菌饼，用接种环挑取3个菌饼，接种于规格为1 000 mL、装有500 mL灭菌马铃薯葡萄糖液体培养基的锥形瓶中，置于温度为(27±1)℃的恒温培养箱中培养30 d，每天摇晃2～3次。

1.2.2 内生真菌粗提物的制备 用2层滤纸将内生真菌发酵物进行真空抽滤，分为菌饼和发酵液。将抽滤剩余的菌饼置于恒温鼓风干燥箱中60 ℃条件下烘干。于锥形瓶中用5倍量的甲醇将粉碎机粉碎后的菌饼干粉浸泡24 h，期间搅拌2～3次，之后抽滤。重复浸提3次，合并滤液后用旋转蒸发器减压浓缩，得菌饼提取物浓缩液。再用旋转蒸发器对抽滤后得到的发酵液进行减压浓缩，得发酵浓缩液。最后将菌饼提取物浓缩液和发酵浓缩液合并，蒸干溶剂，得内生真菌发酵粗提物，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.3 内生真菌粗提物的初步分离 用液液萃取法分离内生真菌粗提物。先用蒸馏水溶解粗提物，然后依次用等量的乙酸乙酯和正丁醇分别萃取5次，合并5次萃取液。用旋转蒸发器减压浓缩至膏状，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及萃余物。

1.2.4 内生真菌粗提物的抑菌活性测定

1.2.4.1 对植物病原真菌菌丝生长的抑制活性 参照钟慧等[15]的菌丝生长速率法测定。先测定质量浓度为5 g/L的DBR-12和DBR-23发酵产物不同溶剂萃取物对10种植物病原真菌菌丝生长72 h的抑制率，筛选出各自抑菌效果较好的病原真菌，然后分别配制6个系列质量浓度的药液，测定其对选定病原真菌的抑制率，用最小二乘法求出毒力回归方程、相关系数(r)、有效中浓度(EC50)及EC50的95%置信限。以百菌清为药物对照，空白对照组用溶剂代替。

1.2.4.2 对动物病原菌的抑制活性 参照万陕宁等[16]的带毒平板法测定。先测定质量浓度为2 g/L的DBR-12和DBR-23发酵产物不同溶剂萃取物对15种动物病原菌生长24 h的抑制活性，筛选出各自具有抑菌效果的病原菌，然后将样品配成系列质量浓度的药液，测定其对选定病原菌的最低抑菌浓度(MIC)。阳性对照组用溶剂代替药液，用于观察细菌能否正常生长；阴性对照则涂无菌水，用于观察培养基、药液或无菌水是否污染。

2 结果与分析

2.1 DBR-12与DBR-23发酵产物不同溶剂萃取物对10种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性

当质量浓度为5 g/L 时，2株内生真菌不同溶剂萃取物与百菌清对10种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性差异较大。由表1可知，DBR-12不同溶剂萃取物对供试植物病原真菌菌丝生长的抑制活性不同，乙酸乙酯萃取物对玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌、甘蔗凤梨病菌和水稻胡麻叶斑病菌的抑制率达100%；正丁醇萃取物对玉米大斑病菌的抑制率达100%。DBR-12乙酸乙酯萃取物对玉米大斑病菌、甘蔗凤梨病菌、贡柑链格孢菌、水稻胡麻叶病菌的抑制活性和正丁醇萃取物对玉米大斑病菌、甘蔗凤梨病菌、水稻胡麻叶病菌的抑制活性均高于百菌清。DBR-23不同溶剂萃取物对10种供试植物病原真菌菌丝生长具有不同的抑制活性，乙酸乙酯萃取物对其中除玉米小斑病菌外的9种植物病原真菌抑制率在90%以上；正丁醇萃取物对10种植物病原真菌抑制活性较差，抑制率均低于80%。DBR-23乙酸乙酯萃取物对玉米大斑病菌、甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌、茶轮斑病菌、贡柑链格孢菌和水稻胡麻叶斑病菌的抑制活性也明显高于百菌清。DBR-12和DBR-23萃余物对供试植物病原真菌无明显抑制活性。

表1 DBR-12与DBR-23发酵产物不同溶剂萃取物对10种植物病原真菌菌丝生长的抑制率 %

注：每列数据后不同字母表示在5%水平上差异显著(DMRT)。

2.2 DBR-12与DBR-23发酵产物乙酸乙酯萃取物对植物病原真菌菌丝的毒力

为进一步明确2株内生真菌乙酸乙酯萃取物的抑菌效果，分别测定DBR-12乙酸乙酯萃取物对6种植物病原真菌(抑制率在75%以上)菌丝的毒力、DBR-23乙酸乙酯萃取物对9种植物病原真菌(抑制率在90%以上)菌丝的毒力，同时测定百菌清对10种植物病原真菌菌丝的毒力，结果见表2。由表2可知， DBR-12乙酸乙酯萃取物对玉米大斑病菌的毒力最高，EC50为0.010 4 g/L，对辣椒炭疽病菌的毒力最低，EC50为 0.079 7 g/L。在该6种供试植物病原真菌中，DBR-12乙酸乙酯萃取物除对玉米小斑病菌的毒力低于百菌清外，其余均高于百菌清。DBR-23乙酸乙酯萃取物对甘蔗凤梨病菌的毒力最高，EC50为0.020 6 g/L，对烟草黑胫病菌的毒力最低，EC50为 0.174 6 g/L。在该9种供试植物病原真菌中，DBR-23乙酸乙酯萃取物除对烟草黑胫病菌和金橘砂皮病菌的毒力低于百菌清外，其余均高于百菌清。

表2 DBR-12与DBR-23发酵产物乙酸乙酯萃取物和百菌清对植物病原真菌菌丝的毒力

2.3 DBR-12发酵产物正丁醇萃取物对5种植物病原真菌菌丝的毒力

为进一步明确DBR-12正丁醇萃取物的抑菌效果，测定其对玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌、甘蔗凤梨病菌、烟草黑胫病菌和金橘砂皮病菌(抑制率在80%以上)菌丝的毒力，结果见表3。由表3可知，DBR-12正丁醇萃取物对金橘砂皮病菌的毒力最高，EC50为0.107 8 g/L，对辣椒炭疽病菌的毒力最低，EC50为 0.646 9 g/L。在该5种供试植物病原真菌中，DBR-12正丁醇萃取物除对甘蔗凤梨病菌的毒力高于百菌清外，其余均低于百菌清(表2、表3)。DBR-12乙酸乙酯萃取物对玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌和甘蔗凤梨病菌的抑制活性明显高于其正丁醇萃取物的活性。

表3 DBR-12发酵产物正丁醇萃取物对5种植物病原真菌菌丝的毒力

2.4 DBR-12与DBR-23发酵产物不同溶剂萃取物对15种动物病原菌的抑制活性

由表4可知，当质量浓度为2 g/L时，DBR-23乙酸乙酯萃取物对15种供试动物病原菌中除伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌外的12种动物病原菌有抑菌活性，其正丁醇萃取物和萃余物均无抑菌活性，表明该菌株的活性物质主要存在于乙酸乙酯萃取物中。DBR-12发酵产物的2种溶剂萃取物和萃余物均无抑菌活性。

表4 DBR-12与DBR-23发酵产物不同溶剂萃取物对15种供试动物病原菌的抑制活性

注：“+”表示有菌生长，“—”表示无菌生长，表5同。

2.5 DBR-23发酵产物乙酸乙酯萃取物对12种动物病原菌的MIC

根据表4结果，将DBR-23发酵产物乙酸乙酯萃取物配成系列浓度梯度，制成带毒平板，测定其对12种有抑菌活性动物病原菌的MIC，以进一步明确其抑菌活性。由表5可知，DBR-23乙酸乙酯萃取物有较高的抑菌活性，其对痢疾志贺氏菌、普通变形杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白色念珠菌和铜绿假单胞杆菌等8种供试菌的MIC为1 g/L，对炭疽杆菌、溶壁微球菌、大肠杆菌和产气肠杆菌等4种供试菌的MIC为 2 g/L。

表5 DBR-23发酵产物乙酸乙酯萃取物对12种供试病原菌的MIC测定结果

3 结论与讨论

本研究中，DBR-12和 DBR-23发酵产物具有较好的抑菌活性，活性物质主要存在于乙酸乙酯萃取物中。内生真菌发酵产物乙酸乙酯萃取物具有广泛的抑菌活性，这与前人的研究结果[17-19]相似。本试验发现，DBR-12乙酸乙酯萃取物仅对植物病原真菌的抑菌活性较好，而DBR-23乙酸乙酯萃取物对动植物病原菌均有抑制活性，抑菌谱广。在5 g/L的质量浓度下，DBR-12发酵产物乙酸乙酯萃取物对玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌、甘蔗凤梨病菌和水稻胡麻叶斑病菌的72 h抑制率达100%，对玉米大斑病菌的毒力最高，EC50为0.010 4 g/L；DBR-23乙酸乙酯萃取物对10种供试植物病原真菌中除玉米小斑病菌外的9种植物病原真菌的72 h抑制率在90%以上，对甘蔗凤梨病菌的毒力最高，EC50为0.020 6 g/L。在2 g/L的质量浓度下，DBR-12发酵产物乙酸乙酯萃取物对动物病原菌无抑菌活性，DBR-23对15种供试动物病原菌中除伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌外12种动物病原菌具有24 h的完全抑制活性，其中对痢疾志贺氏菌、普通变形杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白色念珠菌和铜绿假单胞杆菌等8种供试菌24 h的MIC均为1 g/L。需要指出的是，本试验证明DBR-12和 DBR-23的乙酸乙酯萃取物对多种供试植物病原真菌的抑菌活性均高于化学农药百菌清。另外，在为数不多的对广西地不容内生真菌发酵产物抑菌活性的研究中，DBR-12和 DBR-23发酵产物的抑菌活性明显高于周秋艳等[13]研究的DBR-3和DBR-5的抑菌活性。所以2株广西地不容内生真菌在抑菌剂领域有潜在的开发应用前景，其活性物质及作用机制值得进一步研究，有望开发出天然、安全和高效的新型抗菌剂。

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Inhibitory Activity of Metabolites of Endophytic Fungi DBR-12 and DBR-23 fromStephaniakwangsiensisLo.

LIU Xiaoying,SUN Wenbin,CHEN Jieping,QING Zhen,ZHOU Qiuyan,DENG Yecheng*

(College of Life Science,Guangxi Normal University/Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection,Ministry of Education of China,Guilin 541004,China)

The antimicrobial activity of two endophytic fungi DBR-12 and DBR-23 from tuberous root ofStephaniakwangsiensisLo.was determined in order to provide a basis for their utilization in the field of antimicrobial agent.The endophytic fungi were cultivated in liquid medium to produce metabolites,which were then preliminarily isolated by two-phase solvent liquid liquid extraction method,and the antimicrobial activity of metabolites on 10 plant pathogenic fungi and 15 animal pathogens was measured using mycelial growth rate and poison plate methods.The results showed that acetyl acetate extracts from the fermentation products of endophytic fungi DBR-12 and DBR-23 had high antifungal activity against plant pathogenic fungi.The median effective concentration(EC50) values of DBR-12 to 6 plant pathogenic fungi includingBipolarismaydisand so on were 0.010 4—0.079 7 g/L,with the highest activity againstExserohilumturcicum; the EC50values of DBR-23 to the 10 plant pathogenic fungi except forBipolarismaydiswere 0.020 6—0.174 6 g/L,with the highest activity againstCeratocystisparadoxa.The n-butyl alcohol extract from DBR-12 fermentation product also exhibited high antifungal activity against 5 plant pathogenic fungi includingExserohilumturcicumand so on,and the EC50values were 0.107 8—0.646 9 g/L,with the highest activity againstDiaporthecitri.The minimum inhibitory concentration(MIC) values of acetyl acetate extract from DBR-23 fermentation product against 12 animal pathogens includingShigelladysenteriaeand so on were 1—2 g/L.Fermentation product of DBR-12 showed no antibacterial activity against animal pathogens.The endophytic fungi DBR-12 and DBR-23 fromStephaniakwangsiensisLo.have good antibacterial activity and exhibit a good developmental prospect in the field of antimicrobial agent.

StephaniakwangsiensisLo.; endophytic fungi; metabolites; inhibitory activities

2016-08-12

广西自然科学基金项目(2016GXNSFAA380207，2013GXNSFAA019058)；广西高校科研项目(2013YB037)

刘晓莹(1993-)，女，广西合浦人，在读本科生，研究方向：生物技术。E-mail：872047081@qq.com

*通讯作者：邓业成(1965-)，男，广西全州人,教授，博士，主要从事天然产物及植物保护等研究工作。 E-mail:dyecheng@163.com

S482.2+92

A

1004-3268(2017)03-0075-06