SSR和ISSR技术在植物病原真菌研究中的应用

王 敏

(辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115200)

SSR和ISSR技术在植物病原真菌研究中的应用

王 敏

(辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115200)

本文介绍了SSR和ISSR技术的原理，并从植物抗病基因的鉴定，病原真菌群体遗传和生理小种鉴定，病原菌致病性研究和遗传多样性研究等4个方面综述了这两种技术在植物病原真菌研究中的应用情况。

SSR；ISSR；植物病原真菌

分子标记技术是随着分子生物学的发展而产生的一种先进研究技术，它是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。该技术发展至今已经产生了多种适合不同条件的分子标记技术，如限制性片断长度的多态性标记(RFLP)、简单序列重复标记(SSR)、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、扩展片段长度多态性标记(AFLP)和简单重复间序列标记(ISSR)等。通过对常用分子标记技术特性的比较[1]，发现SSR技术和ISSR技术相对于其他技术所需DNA量少，标记数量丰富，而且分布均匀，实验重复性好，技术难度和实验成本低等优点。因此本文从植物抗病基因的鉴定；病原真菌群体遗传和生理小种鉴定；病原菌致病性研究；遗传多样性研究4个方面综述了这两种技术在植物病原真菌研究中的应用情况。

1 技术介绍

SSR(Simple Sequence Repeat)标记是近年发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA，是一类由几个碱基(一般为1～6个)组成的基序串联重复而成的DNA序列。由于不同等位基因间的重复数存在差异且SSR两侧的序列多是相对保守的单拷贝序列，因此可通过特异引物对基因组总DNA进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性可用作分子标记。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)标记是在SSR基础上发展起来的新型分子标记。该技术以锚定的微卫星DNA为引物，在SSR序列的5′或3′端加锚2～4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。该技术避免了引物在基因组上的滑动，大大提高了PCR扩增的专一性。ISSR技术的引物设计比SSR技术简单，不需要知道DNA序列即可扩增，又可以提示比RAPD、SSR更丰富的多态性[2]。

2 SSR、ISSR分子标记在植物病原真菌研究中的应用

随着分子生物技术的发展，SSR、ISSR技术逐渐应用到植物病原真菌的研究中。这两项技术在植物真菌病害的研究中主要应用于：(1)植物抗病基因的鉴定；(2)病原真菌群体遗传和生理小种鉴定；(3)病原菌致病性研究；(4)遗传多样性研究。

2.1 用于植物抗病基因的鉴定

2003年M.Cakir等人[3]采用SSR、AFLP、RFLP分子标记方法对大麦进行基因绘图来获得条锈病的抗病基因。LIU Shi-Ping等人[4]应用SSR和ISSR分子标记辅助选择大米抗稻瘟病病菌基因，用于珍汕97大米的培育。杜威世等[5]利用SSR分子标记，以海岛棉*陆地棉为杂交亲本，利用其F2代寻找与黄萎病抗性基因有关的标记检测，为分子标记辅助选择育种奠定基础。J.M.Musial等人[6]使用了50个RAPD，104个AFLP和1个SSR标记构建了紫花苜蓿的抗疫霉根腐病基因的基因连锁图。这个基因连锁图能够为将来在分子水平上改进澳大利亚紫花苜蓿提供了落脚点。李韬等人[7]利用AFLP和SSR标记以及非整倍体分析对目的基因进行染色体定位和遗传作图，来获得有利抗性基因资源用以培育抗白粉病小麦品种。孟英等人[8]介绍了SSR的机理，阐述了SSR技术对水稻抗稻瘟病研究的作用，为抗稻瘟病的分子遗传机理研究奠定了基础。马骥超等人[9]综述了SSR标记在小麦抗病QTL分析、抗病基因标记和定位等方面的应用情况。M.J.Christopher等人[10]采用SSR标记技术结合QTLs技术来确认小麦抗黑点病基因，结果表明标记协助的QTLs抗黑点病基因的定位能够增加选择的效率并利用从不同的来源中获取黑点病抗性基因。H.Muranty等人[11]采用微卫星和AFLP标记对冬小麦品系RE714抗白粉病基因进行探测，发现有3个主要的QTLs被微卫星标记所强化，并应用于QTLs的选择。Julie Gold等人[12]通过ISSR法为培育小麦抗锈病基因Sr39和Lr35开发了分子标记。Mucella Tekeoglu等人[13](2000年)采用ISSR标记、RAPD标记等多种分子标记法确定了尖镰孢菌0-5号小种的抗性基因在基因图谱中的位置，然后评定了这两种基因的连锁关系及其与其他所知抗萎焉病基因的关系。张立荣[14]利用ISSR技术对Thatcher及22个以Thatcher为轮回亲本的小麦抗叶锈病近等基因系(NILs)进行分析，构建了一个适宜小麦ISSR分析的最优体系。并通过分析找到了一个与Lr37基因连锁的ISSR标记。康荣华等人[15]对开发SSR技术的两种方法从基本原理和主要步骤两个方面进行了介绍，总结了SSR技术的特点并对其在作物遗传图谱构建、品种鉴定及分子标记辅助育种等方面进展情况进行了综述。

2.2 用于病原真菌群体遗传和生理小种鉴定

Tarakanta JANA 等人[16]应用SSR标记技术对从大豆和棉花中获取的菜豆壳球孢菌的种群基因多态性进行了分析。证明了微卫星技术在种群研究中的作用并为将来使用诊断标记来诊断大豆和棉花病害迈出有力的一步。Claudia Kaye等人[17]对造成大米枯萎病的丝状子囊菌稻瘟病菌包含SSR位点进行了鉴定和描述，并将那些标记添加到完整基因图谱上。Haydar Karaoglu等人[18]对9种分类学上不同的真菌基因组中SSR进行了发生情况、相对丰度、相对密度、普遍性和SSR长度比较分析，研究所得信息可以用作真菌种群基因和变种的鉴定研究。Kaspar Schwarzenbach等人[19]基于SSR标记基因型来探测监控从土壤中提取的真菌种群及其变化，证明方法可行。Treena Burgess等人[20]采用SSR和ISSR技术对取自树木上的内生真菌进行基因多态性扩增来获取供分类学和群体研究的大量的多态性标记。ZHOU Shiguo等人[21]应用ISSR指纹技术来区分葡萄座腔菌属种群及相关的变形真菌，实验表明ISSR技术是区分极相似真菌极有利的手段。Håvard Kauserud等人[22]采用PCR-RFLPs，ISSR及杂交研究评估了芬诺斯堪迪亚木腐病的11种冷杉附毛孔菌的地理性类群。Maria M.Geldenhuis等人[23]采用ISSR分子标记法对烟草根黑腐病菌进行多态性扩增获得特异性引物，这些引物能够应用到重要病原的研究中去，并对世界上不同地区群体结构进行分析。Renbing Zhang等人[24](2004年)采用西瓜的117个由高品质自交系97103与镰刀菌枯萎病菌杂交的重组自交系建立了遗传连锁图谱，遗传连锁图谱包括87个RAPD标记，13个ISSR标记和4个SCAR标记。这个图谱的建立有助于将来对抗枯萎萎焉病菌基因定位的研究。Bernard Slippers等人[25]通过一系列的实验从形态学、培养上和多等位基因DNA序列数据上对Botryosphaeria dothidea,B.ribis和B.parva在形态上进行了区分，并依据分子标记法对分类进行了证实，用ISSR标记的结果再次被证明它可以进行真菌种的鉴定。Håvard Kauserud[26]采用ISSR分子标记法对采自欧洲的干腐真菌Serpula lacrymans进行了分析，证明了5种常见的VCG都属于S.lacrymans种群，并且提出ISSR方法足以区分极接近的真菌种。Christoph R.Grünig等人[27]采用ISSR，RFLP和ITS技术对分布广泛的根部共生体Acephala applanata gen.et sp.Nov进行了分子描述，并对其进行了区分。并证明了ISSR-PCR指纹法只能同其他诊断手段一起来做种的鉴定。Shen Jie等人[28]采用ISSR分子标记法用从76个ISSR引物中选取的10个引物来对8个种群的铁皮石斛进行了鉴别。李海莲[29]对不同地区的14个茄子黄萎病菌进行了ISSR指纹分析，建立了高效的茄子大丽轮枝菌的ISSR反应体系，并对ISSR多态性的扩增及其与不同地理来源、形态类型、致病力和落叶型之间的关系进行了探讨。Prashant K.Mishra等人[30]采用IGS区位和ISSR分子标记两种方法对加拿大艾尔贝塔省和萨斯喀彻温省的小麦中分离的小麦冠腐病菌进行种群间基因多样性分析，研究表明两省分离菌的基因多态性，但是在群体中表现低的基因区别和基因流动性。YU Zhong-dong等人[31]为比较Melampsoralarici-populinaITS的不同，通过调查从中国及其他国家分离的Melampsoralarici-populinaITS序列和ITS多基因树，还通过ISSR方法来研究它们的基因分化。结果表明ITS区域是保守的，不适于研究已经存在于种之间的区别，而ISSR标记可以用来进行种内种群研究。冯淑杰等人[32]研发了一套基于稻瘟病菌测序菌株70～15全基因族序列的121个微卫星标记，利用这些标记对无毒基因AvrPi7位点进行了连锁分析。Nguyen Anh Nghia等人[33]应用形态学特征及ISSR标记技术对从马来西亚橡胶园中分离的21种橡胶棒孢霉叶斑病菌进行了分类。

2.3 用于病原菌致病性研究

姜占发[34]应用ISSR技术对我国主要棉区大丽轮枝菌进行分子指纹分析，将供试的28株大丽轮枝菌分为SISG1、SISG2、SISG3、SISG4、SISG5、SISG6、SISG7共7个亚群，结果表明：每个亚群致病力与ISSR多态性表现出相关性；多态性、致病力与地理来源均未表现出相关性。马鸿文等人[35]采用ISSR技术，研究了7个不同菌株的多态性、致病力分化和地理来源的关系。研究发现，苜蓿褐斑病具有丰富的遗传多样性，不同地理来源的菌株有明显的遗传分化现象，菌株的致病力差异与ISSR遗传聚类组群的划分有一定的相关性，但与地理来源没有明显的相关性。

2.4 遗传多样性研究等方面

MENG Xiangqi等人[36]采用AFLP和ISSR技术对从豆科植物中分离的46种大豆茎褐腐病菌进行了基因多样性探测，并证明ISSR技术对该种菌的探测比AFLP技术更加经济有效。张勇等人[37]l利用SSR技术对以望水白/安农8455的一粒传产生的重组自交系进行对抗赤霉病QTLs的筛选，结果发现：75个引物在两亲本间有高达32.47%的多态性，其中5个引物在两个亲本和抗、感病间均有相同的多态性。Regina S.Redman等人[38]使用SSR标记等方法对生长于太平洋东北部奥林匹克半岛的Cantharellus formosus的群体基因性状进行分析。Cyril Dutech等人[39]应用SSR等分子手段对实验中所得的多态性是否是从真菌中所获得，进行了论证。杜青等人[40]利用SSR技术对抗疫霉根腐病的大豆品种(系)进行了遗传多样性分析，结果表明：抗疫霉根腐病大豆品种(系)间的遗传差异较大，通过聚类分析将166个品种分为6类。姚国胜等人[41]利用Pi4B和Pi4G两个引物对来自河北和黑龙江省的58个马铃薯晚疫病菌株基因组DNA进行了SSR基因型鉴定，分析了其遗传多样性。该研究完善了晚疫病菌研究的分子标记体系。贾少锋等人[42]建立了小麦白粉病的ISSR扩增体系，明确了各引物的退火温度，筛选出一些多态性较好的ISSR引物，并对小麦白粉病的遗传多样性和菌株毒性的关系进行了比较和分析。何瑞等人[43]确立了镰刀菌的ISSR-PCR的最适反应条件，对27株镰刀菌进行ISSR的遗传多态性分析，结果表明，供试的27株镰刀菌可分为3大类，两个亚类，并对它们的亲缘关系进行了分析。王子迎等[44]采用ISSR技术对来自中国黑龙江省、福建省和美国的3个大豆疫霉地理群体的遗传多样性进行了分析，研究了中国和美国大豆疫霉的遗传关系。

3 结束语

SSR和ISSR标记发展至今，已经是十分成熟的标记技术。实践证明，它们可以被应用于许多研究领域中，是可靠高效的标记技术。尤其是ISSR技术无需预先克隆和测序，而且多态性较高，信息量大，是一种应用前景广泛的DNA标记技术。今后，可扩大其应用范围，例如将其应用在动植物遗传育种领域，生药研究开发领域；就分析标记本身，其发展也是无止境的，可以朝着多引物，通用引物方向发展，在加强经典DNA标记技术的完善与改进，另一方面加快新型DNA标记的开发，使分子标记技术向着简便，快速，准确的方向发展。

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Application of SSR and ISSR Techniques in the Study of Plant Pathogenic Fungi

WANG Min

(Poplar Institute of Liaoning Province,Gaizhou 115200,China)

In this paper a description is given of the principle of SSR and ISSR technology,and the application of these two technologies is summarized in researches on plant pathogenic fungi from the identification of plant disease resistant gene,pathogenic fungi population genetic and small-kind physiological identification,pathogen pathogenicity research and genetic diversity.

SSR,ISSR,Plant pathogenic fungi

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.01.010

2016-11-25

国家林业局“948”项目(2014-4-02)。

王敏(1974-)，女，辽宁盖州人，本科，高级工程师,从事林业技术工作。

S763.15

A

1003-5508(2017)01-0046-05