老年性痴呆血瘀证病证结合树鼩模型的初步建立及三七总皂苷干预的评价

陈奔+覃梅春+黄金兰+吴登攀+郭尔楚+刘志萍+许哲郝++郭茜茜+钟振国

[摘要]初步建立老年性痴呆血瘀证病证结合树鼩动物模型并以三七总皂苷进行药物干预，以该药物反证该病证结合模型的稳定性。以5种中医表征分析方法及凝血4项指标、血浆NO含量、血浆SOD含量评价各组树鼩模型的血瘀证水平；以免疫印迹试验（Western blot）检测各组树鼩大脑Aβ142蛋白、淀粉样蛋白前体蛋白（APP）、磷酸化Tau蛋白（PTau）含量；HE染色观察各组树鼩大脑海马神经细胞形态，免疫组化法检测各组树鼩大脑海马胆碱乙酰基转移酶（ChAT）与突触素（SYP）含量。通过实验得出病证结合组树鼩血瘀证中医表征较AD组显著，给药组树鼩血瘀证表征较病证结合组减轻；与空白组相比，AD組树鼩大脑中Aβ142，APP及PTau含量降低，ChAT及SYP的平均阳性截面积/A降低，病证结合造模使这一降低加重，而三七总皂苷给药缓解了这一变化。说明AD血瘀证病证结合树鼩模型具有稳定性。

[关键词]老年性痴呆病； 血瘀证； 病证结合动物模型； 树鼩； 三七总皂苷

[Abstract] To establish the integration of Alzheimer′s disease（AD） and blood stasis syndrome tree shrew model. Panax notoginseng saponins （PNS） was used to intervene the model to testify the stability of the model. The level of blood stasis of each group in the tree shrew model was evaluated by analyzing five traditional Chinese medicine（TCM） characterizations， four blood coagulation indexes， plasma nitric oxide （NO） level， plasma superoxide dismutase （SOD） level in each group. Hematoxylin and eosin（HE） staining was used to observe the morphological changes of brain hippocampal neuron cell of each group. Immunohistochemical staining was used to assay the ChAT and SYP levels in brain hippocampus of each group.The blood stasis characterization of the integration of disease and syndrome group was more obvious than the AD group， and that of the drug administration group was lower than that of the integration of disease and syndrome group. Aβ142， APP， PTau， ChAT and SYP level of AD group were lower than those in the blank group， which were further reduced in the model of integration of disease and syndrome. However， the administration of PNS relieved the reduction， indicating that the AD and blood stasis integration syndrome tree shrew model is stable.

[Key words]Alzheimer′s disease； blood stasis syndrome； integration of disease and syndrome animal model； tree shrew； Panax notoginseng saponins

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease）是一种慢性进行性智力损害疾病，被认为是在老年群体中最普遍的一种痴呆类型[1]。主要表现为年老者语言、记忆、认知、情感、性格和行为的功能性缺失。目前估计已有3 600万人患上AD，这个数字预计到2050年会变为11 800万[2]。AD已经逐渐成为社会和医药学科发展的主要问题。先前的研究显示了AD的病理特征包括细胞外沉积老年斑，细胞内神经原纤维缠结的形成，产生在大脑皮层、海马和大脑其他区域的胆碱能神经元损害及突触改变[3]。而且认识到AD进程涉及多种因素包括凋亡、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应、能量代谢失衡。近期研究能减慢AD病人病情恶化的方法包括胆碱酯酶抑制剂和N甲基D天冬氨酸（NMDA）受体激动剂，但是这些方法没有一个能对阻止AD病情发展起到深远意义[45]。中药已经有治疗AD很长一段历史，几千年的用药经验，传统中药已有预防和治疗AD丰富的理论和宝贵的经验[6]。传统中药很多不同组分组成的处方临床上都用来治疗AD，如六味地黄丸、养心汤、天麻钩藤饮[7]。课题组前人也研究了三七总皂苷对AD的治疗作用[8]。在理论上，传统中医认为，AD是由于年高肾衰精亏、气虚血少，以至髓海失养，或因脾虚痰浊内生而蒙蔽清窍，神识不清，或气滞、瘀血内阻，脏腑化生之气血不能上荣于脑，脑海不充而形成。病位在脑，其中肾虚为AD发病的根本原因，而血瘀是其重要的病理发病因素。现研究多从肾虚证入手研究老年痴呆动物模型，少有血瘀证与AD的病证结合动物模型研究。树鼩与人类某些基因具有较高的相似性[11]，与灵长类有较高的亲缘关系，且在生理解剖上与人类具有极高相似度，因此，以树鼩为对象构建的AD模型更能模拟人类AD发病。本实验初步建立老年性痴呆血瘀证树鼩动物模型，并以三七总皂苷进行干预，验证该模型的稳定性。

1材料

11动物

中缅树鼩滇西亚种普通级，60只，雄性，体重120～140 g，饲养时间为10～12月龄，由昆明医科大学实验动物学部提供，生产许可证号SCXK（滇）K20130002，合格证号SYXK（滇）K20130002。引进后饲养于广西中医药大学清洁级动物实验中心，温度22～25 ℃，湿度50%～60%，每天定时清扫粪便1次，适应性饲养1周。

12试剂

角叉菜胶（Sigma公司，批号CAS9000071）；水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号20130513）；D半乳糖（Sigma公司，批號G0625）；鹅膏蕈氨酸（Sigma公司，批号BGBC2055VF）；Aβ2535（Sigma公司，批号053M4804V）；三七总皂苷（云南维和药业股份有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo，批号PICPI23223）；Aβ142抗体（Abcam，批号Ab39377）；APP（Sigma公司，批号SAB5200113）；PTau（Santa cruz，批号sc23468）；GAPDH（CST，批号#5174）；羊抗兔HRP标记二抗（批号A0208）、驴抗山羊HRP标记二抗（批号A0181）、羊抗鼠HRP标记二抗（批号A0216）均购于碧云天公司。

13仪器

DW2000脑立体定位仪（成都泰盟软件有限公司）；微量注射器（上海高鸽工贸有限公司）；Tanon5200成像系统（Tanon）；CX41正置显微镜（OLYMPUS公司）；PPTHK21B石蜡切片机（徕克公司）；IMS图像分析系统[基尔顿生物科技（上海）有限公司]；D5100数码相机（NIKON公司）；Sysmex CA7000全自动凝血分析仪（日本希森美康株式会社）。

2方法

21动物分组及处理

雄性滇西亚种树鼩60只，分为4组，每组15只：空白组、AD模型组（以下称AD组）、AD血瘀证模型组（以下称病证结合组）、三七总皂苷给药组（以下称给药组）。将AD组、病证结合组、给药组全部树鼩进行大脑定位给药的三维坐标[9]定位，并在双侧脑室分别缓慢注射孵育好的Aβ25351 μL （10 g·L-1）和鹅膏蕈氨酸1 μL（5 g·L-1）共2 μL的混合溶液。空白组依照三维坐标在双侧脑室分别注射2 μL生理盐水。待头部皮肤愈合后，将病证结合组、给药组角叉菜胶溶液腹腔注射（75 mg·kg-1），连续3 d。空白组、AD组腹腔注射等剂量的生理盐水，连续3 d。给药组于第4天进行三七总皂苷溶液灌胃给药（200 mg·kg-1[10]），其余3组树鼩以等容量的生理盐水灌胃，连续10 d。

陈奔等：老年性痴呆血瘀证病证结合树鼩模型的初步建立及三七总皂苷干预的评价22树鼩中医表征采集

在血瘀证造模最后一天48 h后给药组进行连续10 d PNS的灌胃给药，并在给药最后一天进行所有树鼩的足爪皮肤、鼻唇部皮肤、舌底的图像采集，观察所有树鼩的精神状态以及有无抓捕抵抗。

23凝血4项检测

以Sysmex CA7000全自动凝血分析仪及Sysmex配套试剂盒进行检测。

24血清NO含量及SOD活力的测定

各组血清中的NO含量采用硝酸还原酶法进行测定，SOD采用WST1法测定，均按试剂盒说明书进行操作。

25Western blot测定脑组织中Aβ142，APP，PTau含量

将树鼩脑组织剪成细小的碎片，加入裂解液，提取总蛋白质并进行定量。上样量为80 μg蛋白，Aβ142（1∶1 000），APP（1∶500），PTau（1∶1 000），GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，HRP（1∶1 000）标记的二抗孵育1 h后显色分析条带。

26HE染色及免疫组化法检测脑神经细胞损伤

HE染色：常规方法对各组树鼩大脑海马部位固定、洗涤与脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片和脱蜡、水化、苏木素染色、伊红染色、透明和封片，通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位。免疫组化：各组样品玻片放在65 ℃恒温烘箱中烤片30 min后经脱蜡、水化、抗原修复、阻断，滴加一抗，湿盒孵育，室温下放置1 h，滴加HRP标记广谱二抗，室温下放置30 min，DAB染色、苏木素复染，将玻片置于二甲苯中透明后中性树胶封片，放入65 ℃烘箱中15 min。显微镜拍照，采集分析样本相关部位，计算阳性面积。

3结果

31中医表征结果分析

311足爪、舌底、鼻唇部变化用Photoshop CS6计算某一图像区域R（红色值）、G（绿色值）、B（蓝色值）三分量值，与空白组相比，AD组足爪、舌底、鼻唇部平均值R，G，B有降低趋势，但无显著性差异，提示AD组足爪、舌底、鼻唇部颜色与空白组无明显差别；与AD组相比，病证结合组足爪、舌底、鼻唇部平均值R，G，B均明显降低（P<001），提示病证结合组树鼩足爪颜色比AD组树鼩颜色变深，舌底颜色比AD组树鼩颜色暗紫，鼻唇部皮肤颜色比AD组树鼩颜色偏黯黑；与病证结合组相比，给药组树鼩足爪平均值R，G，B均明显升高（P<001），提示给药组树鼩足爪颜色与病证结合组相比由黯黑向肉红色恢复，舌底由暗紫向淡红色恢复，鼻唇部由黯黑向肉红色恢复。各组足爪平均值R，G，B见表1。不同组间树鼩足爪、舌底、鼻唇部颜色图像见图1。

312抓捕抵抗空白组、AD组、病证结合组的抓捕抵抗率呈上升趋势，提示大脑双侧注射给药的AD造模树鼩有一定的固定性疼痛，腹腔注射角叉菜胶的血瘀证诱导证型加重了这一表征。与病证结合组相比，给药组抓捕抵抗率有下降趋势，提示三七总皂苷对缓解固定性疼痛有一定作用。各组树鼩的抓捕抵抗个数所占每组动物个数比率见表2。

313抱头空白组、AD组、病证结合组的抓捕抵抗率呈上升趋势，提示大脑双侧注射给药的AD造模树鼩有个别精神状态萎靡，腹腔注射角叉菜胶的血瘀证诱导证型加重了这一表征。与病证结合组相比，给药组抱头概率有下降趋势，提示三七总皂苷对抗精神萎靡有一定作用。各组树鼩抱头个数所占每组动物个数比率见表3。

314给药期间给药组足爪R，G，B的变化在给药后第2天到第10天，随着三七总皂苷给药天数的增加，三七总皂苷给药组的足爪颜色平均值R，G，B呈现逐渐升高的趋势，提示随着给药天数增加，组内树鼩足爪颜色由黯黑向肉红色转变见表4。

32凝血4项检测

与空白组比较，AD组的APTT，TT显著减少（P<005或P<001），PT有减少趋势，FIB显著增加（P<001），提示AD组与空白组相比凝血因子活性增高，血液处于高凝状态。与AD组相比，病证

结合组APTT，PT，TT显著减少（P<005或P<001），FIB有增加趋势，提示病证结合组与AD组相比凝血因子活性增高，高凝状态增加。与病证结合组相比，给药组APTT，PT，TT显著增加（P<001），FIB显著降低（P<001），提示三七总皂苷给药能够有效减轻AD血瘀证病证结合造模树鼩的血液高凝状态，见表5。

33血清NO含量及SOD活力的测定

各组血清NO含量及SOD活力见表6。与空白组相比，AD组血清的NO含量无明显变化。与AD

组相比，病证结合组血清的NO含量明显降低（P<005），提示由角叉菜胶造模引起的病证结合组动物血管内皮有明显损伤。与病证结合组相比，给药组树鼩血清中NO含量有升高趋势，提示三七总皂苷对血管内皮有一定的保护作用。与空白组相比，AD组血清的SOD活力无明显变化。与AD组相比，病证结合组血清的SOD活力明显降低（P<005），侧面佐证血清中由角叉菜胶造模引起的病证结合组动物血管内皮可能有损伤。与病证结合组相比，给药组树鼩血清中SOD活力有升高趋势。

34脑组织中Aβ142，APP，PTau含量

各组树鼩脑组织中APP，Aβ142，PTau蛋白印迹的定量分析见图2。Aβ142灰度值显示，与空白组比较，AD组Aβ142的灰度值有明显增多（P<001）；与AD组比较，病证结合组Aβ142灰度值明显增多（P<005）；与病证结合组相比，给药组Aβ142含量显著减少（P<001）。APP灰度值显示，与空白组比较，AD组APP的含量显著增加（P<001）；与AD组比较，病证结合组APP含量明显增加（P<005）；与病证结合组相比，给药组APP含量显著减少（P<001）。磷酸化Tau蛋白（PTau）的灰度值显示，与空白组比较，AD组PTau含量明显增多（P<001）；与AD组比较，病证结合组PTau灰度值明显增多（P<001）；与病证结合组相比，给药组PTau含量显著减少（P<001）。

35大脑皮质部HE染色切片

光镜下，空白组树鼩大脑皮质部神经细胞饱满，胞体充盈，排列整齐并且紧密。AD组神经细胞出现核缩小、凝聚的核固缩状态，提示部分细胞核已经停止DNA转录。病证结合组神经细胞排列疏松，核固缩严重，部分细胞处于核碎裂与核溶解状态，提示病证结合组的神经细胞严重凋亡。给药组神经细胞排列较整齐，胞体较为饱满，显示三七总皂苷有一定的治疗效果，见图3。

36大脑皮质部免疫组化切片检测ChAT与SYP

361图像分析ChAT检测：空白组可见复染

与空白组相比1）P<001；与AD组相比2）P<005，3）P<001；与病证结合组相比4）P<001。

细胞核排列整齐，存在大量的ChAT阳性神经元，其阳性物质主要存在于胞浆与包膜内，显黄色，细胞排列紧密、整齐；AD组细胞出现核溶解现象，细胞核分布松散，ChAT阳性神经元数量明显减少，胞体破裂缩小，出现核固缩，排列较松散。病证结合组基本不见复染的细胞核，出现大量空泡，ChAT阳性神经元数量明显减少，无完整结构，胞体缩小，出现核固缩，染色加深，排列较松散，阳性物质较少。给药组细胞核复染较病证结合组明显，ChAT免疫阳性产物部分分布于细胞间，部分细胞变形，但整体观察ChAT阳性产物多于病证结合组，见图4。SYP检测：空白组可见复染细胞核排列整齐，SYP阳性产物多见于胞浆且均匀分布。AD组细胞出现核溶解现象，细胞核分布松散，SYP免疫阳性产物部分溶出，分布不均。病证结合组出现核深染与核固缩，基本不见完整细胞形态，SYP免疫阳性产物黄色区域基本不见。给药组细胞核保留较多，SYP免疫阳性产

物部分分布于细胞间，部分细胞变形，但整体观察SYP阳性产物明显多于病证结合组，见图5。

362平均截面积/A各组ChAT与SYP阳性反应平均截面积/A见表7。与空白组比较，AD组的乙酰胆碱转移酶免疫阳性神经元细胞平均截面积/A均有明显降低，且有显著性差异（P<001）。与AD组比较，病证结合组乙酰胆碱转移酶免疫阳性神经元细胞平均截面积/A明显减少（P<001）。与病证结合组比较，给药组的乙酰胆碱转移酶免疫阳性神經元细胞平均截面积/A有所增加（P<001）。与空白组比较，AD组的突触素阳性反应产物平均截面积/A均有明显降低（P<001）。与AD组比较，病证结合组突触素阳性反应产物平均截面积/A明显减少（P<001）。与病证结合组比较，给药组的突触素阳性反应产物平均截面积/A有所增加（P<001）。

4讨论

王绘山等[11]研究表明从氨基酸序列以及分子

高级结构上看，树鼩的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）与人有高度的相似性，基于VEGF进化分析显示，树鼩与人的亲缘关系较啮齿目更近。因此以树鼩作为老年性痴呆病与血瘀证的研究对象比大鼠、小鼠更有意义。根据2010年全国中西医结合血瘀证及活血化瘀研究学术大会《血瘀证中西医结合诊疗指南（修订稿）》其中5个诊断标准：“舌质暗紫或舌体瘀斑、瘀点，舌下静脉曲张瘀血；面部、唇、齿龈及眼周紫黑；皮下瘀斑；固定性疼痛或刺痛、绞痛；精神异常”，本课题筛选出与树鼩相适应的中医表征——①舌质暗紫、②鼻唇部黧黑、③足爪肌肤黯黑、④抓捕抵抗与疼痛抵抗、⑤精神萎靡、抱头。其诊断方法类似于“四诊”中的“望”。但采用人肉眼观察难免有很大主观性，难以令人信服，因此课题组自主设计了表征分析软件，以图像R，G，B为分析原理，将皮肤颜色具象为数据，可以进行统计学分析。而抓捕抵抗与精神萎靡则通过特定动作测试，计算每组出现规定动作的动物概率。关于动物分组，实验前分组每组15只，由于三七总皂苷干预前对树鼩造模，进行了脑外科手术导致感染致一部分动物死亡，而给药组与病症结合组动物死亡较多，因此给药组与病证结合组动物数较少。

本實验中凝血4项、一氧化氮（NO）与超氧化物歧化酶（SOD）的含量检测是用来判断是否获得血瘀证的辅助实验室指标。凝血4项具体是指检测PT，TT，APTT，FIB 4项凝血指标，其中，PT是外源性凝血情况检测中最常用的一种实验，可以对凝血因子Ⅱ，Ⅴ和Ⅶ，Ⅹ作出比较客观的反应；TT是对共同的凝血途径及情况均能准确反应的试验，APTT是内源性凝血情况检测最常用的实验，可以对凝血因子Ⅷ，Ⅸ及Ⅺ，Ⅻ的活性作出反应；FIB是一种急性时相的反应蛋白，凝血功能亢进，即高凝状态时，FIB升高的幅度明显[12]。NO是心血管系统重要的调节和保护因子，在血管内皮细胞中由NOS催化L精氨酸生成，其本质是一种反应性极强的自由基，在体内的半衰期仅1～5 s，产生后可迅速失去生理活性，在有氧条件下生成稳定的代谢产物硝酸盐和亚硝酸盐。NO的血浆浓度水平，不但可以作为反映内皮损伤状况的可靠指标，而且可作为反映心血管疾病轻重的有效指标。将其引入中医辨证，具有相对特异性。多数研究结果表明，NO与血瘀证关系密切。另有大量实验证实[1314]，体内脂质过氧化反应增强，清除氧自由基能力减弱，造成体内自由基反应紊乱，可导致微循环障碍、血瘀证。因此，检测血清中SOD的活力可以侧面反映血瘀证的程度以及血管内皮损伤程度。研究结果显示，空白组、AD组、病证结合组的PT，TT，APTT依组间顺序减少，而FIB依组间顺序增高，NO含量、SOD活力水平逐渐降低，说明老年性痴呆造模会引起一定的血液高凝状态与血管内皮损伤，而附加的血瘀证引导证型会增加血液的高凝状态的程度。在这一方面可以看到，老年性痴呆与血瘀证是有内在联系的。给药组的PT，TT，APTT均较病证结合组升高，且FIB减少，NO含量与SOD活力均较病证结合组上升，证明三七总皂苷对AD血瘀证病证结合有一定疗效。

目前研究表明，β淀粉样蛋白（βamyloid protein，Aβ）毒性作用被认为是AD发病的中心环节。Aβ是由分泌酶（secretase）水解淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）生成的。分泌酶有α，β和γ 3种，由αsecretase水解APP所产生的sAPPα是可溶性无毒物质，具有营养神经的作用；而由βsecretase水解APP所产生的sAPPβ，再经γsecretase水解生成可溶性Aβ，可溶性Aβ并无神经毒性，但其结构异常（如β折叠）则可变成具有神经毒性不可溶的沉淀Aβ。Aβ大部分是含40个氨基酸残基的Aβ140，而只有小部分是含42个残基的变异体Aβ142。Aβ142变异体比Aβ140疏水性更强，更易形成纤维化和沉淀。Aβ沉积造成胆碱能神经细胞损伤、胆碱乙酰基转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）水平下降和乙酰胆碱递质合成不足[1517]，以及调节神经递质释放的递质囊泡膜蛋白突触素（synapsin）水平下降[18]从而影响递质释放，最终导致记忆减退和行为异常。本实验以Western blot检测了各组树鼩大脑组织中的Aβ142，APP及PTau蛋白，其能有效反映树鼩大脑淀粉样蛋白沉积程度以及老年斑形成程度；以免疫组化法研究了各组树鼩大脑皮质细胞ChAT与SYP含量。

研究表明，病证结合组树鼩的足爪、鼻唇部皮肤、舌底颜色较AD组明显加深，符合血瘀证诊断标准；而给药组足爪、鼻唇部皮肤、舌底颜色有好转趋势，逐渐向肉色恢复。病证结合组抓捕抵抗概率与抱头概率均较AD组出现一定概率的基础上明显升高，符合血瘀证诊断标准；而给药组较病证结合组明显降低，总体说明了该表征采集方法的稳定性。空白组、AD组、病证结合组的PT，TT，APTT依组间顺序减少，而FIB依组间顺序增高，NO含量、SOD活力水平逐渐降低，说明老年性痴呆造模会引起一定的血液高凝状态与血管内皮损伤，而附加的血瘀证引导证型会增加血液的高凝状态的程度。在这一方面可以看到，老年性痴呆与血瘀证是有内在联系的。给药组的PT，TT，APTT均较病证结合组升高，且FIB减少，NO含量与SOD活力均较病证结合组上升，证明三七总皂苷对AD血瘀证病证结合有一定疗效。与空白组相比，AD组树鼩大脑中NE，Aβ142，APP及PTau含量降低，ChAT及SYP的平均阳性截面积/A降低，病证结合造模使这一降低加重，而三七总皂苷给药缓解了这一变化，侧面证明了AD血瘀证病证结合树鼩模型的稳定性。通过以上指标变化也显示，老年性痴呆病与血瘀证存在机制上的联系，但确切机制是什么，需要进一步的探索。

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[責任编辑张宁宁]