UFLCQTRAPMSMS同时测定蚁巢伞属3种鸡中氨基酸核苷含量及PCA分析

张园娇+胡鹏+马赟+蔡静+李月+李祥+陈建伟

[摘要]建立高分离度快速液相色谱质谱联用（UFLCQTRAPMSMS）同时测定蚁巢伞属3种鸡中15种氨基酸和12种核苷类成分的方法。采用Waters XBridge Amide 色谱柱（21 mm×100 mm，35 μm），流动相为02%甲酸水02%甲酸乙腈，梯度洗脱，柱温30 ℃，流速06 mL·min-1，采用电喷雾正离子源（ESI+），多反应离子监测（MRM）模式进行检测。采用PCA主成分分析法对不同品种的蚁巢伞属鸡进行综合评价。结果15种氨基酸成分和12种核苷成分在一定浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数均大于0997 3，精密度，重复性和稳定性良好；加样回收率在9514%～1050%，RSD均小于50%。PCA分析显示在氨基酸中，鸡综合评价指数分最高；在核苷中，黄鸡综合评价指数最高。所建立的方法准确、重复性好，可用于蚁巢伞属3种鸡中15种氨基酸和12种核苷类成分的同时测定，为蚁巢伞属鸡资源内在质量的综合评价、全面控制以及合理开发应用提供新的方法参考。

[关键词]蚁巢伞属； 氨基酸； 核苷； 含量测定

[Abstract]A comprehensive analytical method based on UFLCQTRAPMSMS was developed for the simultaneous determination of 15 kinds of amino acids and 12 kinds of nucleosides of three species in Termitomyces The separation was carried out on a Waters XBridge Amide column （21 mm×100 mm，35 μm） with gradient elution of mobile phase of 02% formic acid in water02% formic acid in acetonitrile at a flow rate of 06 mL·min-1， and column temperature was maintained at 30 ℃ The target compounds were analyzed by the positive ion multiple reaction monitoring （MRM） mode The principal component analysis（PCA） was made to standardized treatment for the comprehensive evaluation of different species in Termitomyces The 15 kinds of amino acids and 12 kinds of nucleosides multiple constituents showed good linearity （r>0997 3） in the range of the tested concentrationThe average recoveries ranged from 9514% to 1050%，and the relative standard deviations were less than 50% The comprehensive evaluation index obtained with PCA showed that the Termitomyces albuminosus was significantly higher than others in amino acids and in nucleosides， of which the T aurantiacus was the best The developed method with good repeatability and accuracy was suitable for the simultaneous determination of multiple functional substances，which provided a new basis for the comprehensive assessment and overall control of the quality of Termitomyces fungi

[Key words]Termitomyces； amino acids； nucleosides； simultaneous determination

雞菌为担子菌亚门Basidiomycotina层菌纲Hymenomycetes伞菌目Agaricales离褶伞科Lyophyllaceae蚁巢伞属（原称鸡菌属）Termitomyces真菌鸡菌T. albuminosus （Berk） Heim的干燥子实体，是一类生于白蚁巢上的珍贵野生食药用菌。鸡菌属主要分布于非洲热带、亚洲热带、南太平洋岛屿和亚洲的亚热带地区，在我国主产于西南的云贵川，东南的福建和台湾等地，由于该菌与某些白蚁有互惠的共生关系，故其分布范围与大白蚁群Macrotermitinae的分布界限极为相近[17]。明代李时珍《本草纲目》[8]上就记载有“益胃，清神，治痔”的功效。现代研究表明，鸡菌具有抗氧化[9]、抗胃溃疡[10]、降血脂[11]、增强免疫功能[12]、镇痛抗炎[13]等药理作用。其不仅含有多糖、多酚等多种生物活性成分，还含有丰富的氨基酸、核苷等营养物质。

目前国内外对鸡菌功效物质研究主要集中于多糖、多酚等，核苷类成分尚未见报道，对于氨基酸的测定比较局限，大多需要经过衍生化处理，然而，大部分的衍生化法都具有衍生化试剂不稳定、操作繁琐、耗费时间以及产生副产物干扰测定等缺点[1415]。同时核苷类成分具有重要的生理功能，能够调节机体代谢功能，增强抗病能力，对肝脏、心血管及神经系统有重要的作用[16]。同时，近年来越来越多的研究证实人体内的某些氨基酸不仅作为蛋白质合成的底物原料，是人体生长发育必不可少的营养物质，也是神经递质、卟啉类化合物、聚胺类化合物合成的前体[17]。此外，氨基酸可用于分辨物质来源和保质期[1819]。

本实验通过高分离度快速液相色谱质谱联用（UFLCQTRAPMSMS）同时测定蚁巢伞属3种鸡中15种氨基酸和12种核苷类成分的含量，结合主成分分析（PCA）[2021]，能快速便捷了解不同品种的野生鸡中氨基酸和核苷的分布，为鸡资源的质量控制与合理开发应用提供了科学依据。

1材料

ABSciex QTRAP 5500三重四级杆线性离子肼串联质谱仪（美国ABSciex公司）；LC20A快速液相仪（配有DGU20A3在线脱气机、LC20ADXR泵、SIL20AXR自动进样器及CTO20AC柱温箱，日本Shimadzu公司）；KH500DB型数控超声波清洗器（100 kHz，昆山禾创超声仪器有限公司）；离心机（TGL16B，上海安亭科学仪器厂）；SArtorius BT125D电子天平（1/10万，德国赛多利斯公司）；ME36S型电子天平（1/100万，德国赛多利斯公司）。

15种氨基酸对照品甘氨酸（glycine，批号B21915），丙氨酸（alanine，批号B21911），丝氨酸（serine，批号B21932），脯氨酸（proline，批号B21914），缬氨酸（valine，批号B21936），苏氨酸（threonine，批号B21933），亮氨酸（leucine，批号B21925），天冬氨酸（aspartic acid，批号B21934），谷氨酸（glutamic acid，批号B21916），赖氨酸（lysine，批号B21922），甲硫氨酸（methionine，批号B21913），组氨酸（histidine，批号B21938），苯丙氨酸（phenylalanine，批号B21910），精氨酸（arginine，批号B21920），酪氨酸（tyrosine，批号B21924）。上海源叶公司，纯度均大于98%。

12种核苷类对照品尿嘧啶（uracil，批号100469200401），腺嘌呤（adenine，批号110886200001），次黄嘌呤（hypoxanthine，批号B20211），鸟嘌呤（guanine，批号140631200904），2′脱氧胞苷（dideoxycytidine，批号YSJ04024），胸苷（thymidine，批号1001182663），胞苷（cytidine，批号100982718），尿苷（uridine，批号887200202），2′脱氧鸟苷（dideoxyguanosine，批号1000943454），腺苷（adenosine，批号110879200202），肌苷（inosine，批号40669201104），鸟苷（guanosine，批号1001103046）。美国Sigma公司，纯度均大于98%。

水为超纯水，乙腈（色谱纯，德国默克公司），甲酸（色谱纯，德国默克公司）。

蚁巢伞属鸡类真菌编号及来源如下：S1鸡采自云南楚雄彝族自治州，为鸡菌T albuminosus的干燥子实体；S2灰鸡采自云南白族自治州，为灰鸡菌T eurrhizus （Berk） Heim的干燥子实体；S3黄鸡采自四川绵阳，为金黄鸡菌T aurantiacus Heim的干燥子實体。

以上材料均经南京中医药大学陈建伟教授鉴定。

以上材料分别低温烘干并粉碎成细粉，过120目筛，放置干燥器中备用。

2方法与结果

21色谱条件色谱柱Water XBridge Amide （21 mm×100 mm，35 μm）；流动相水（含02%甲酸，A）乙腈（02%甲酸，B）；梯度洗脱0～25 min，15% A；25～5 min，15～50% A；5～7 min，50%A；7～8 min，50～15% A；8～11 min，15%A。柱温30 ℃，流速06 mL·min-1，进样量2 μL。

22质谱条件离子化方式电喷雾正离子（ESI+），多反应监测离子扫描模式（MRM）测定，主要质谱参数为气帘气（curtain gas）为35 psi（1 psi=6895 kPa），Gas1为55 psi，Gas2为55 psi，温度（TEM）为550 ℃，喷雾电压（ionspray pressure）为5 500 V，同时对检测离子对，去簇电压（DP）、碰撞能量（CE），进行优化，27种目标成分的质谱检测参数列于见表1。

23对照品溶液的制备精密称取甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤、2′脱氧胞苷、胸苷、胞苷、尿苷、2′脱氧鸟苷、腺苷、肌苷、鸟苷对照品适量，加纯水配制成8016，7 4736，4 9300，6012，8048，20 3200，9880，5 9400，4 0560，4 9400，9960，7904，9940，1 5904，2004，3 9360，784，9920，7380，497，800，6060，3 0480，990，3944，4064，5880 mg·L-1的对照品储备液。取各对照品储备液适量，加水定容至100 mL制成混合对照品溶液，并逐级稀释，得到一系列不同浓度的15种氨基酸和12种核苷类混合对照品溶液，4 ℃保存，备用。

24供试品溶液的制备精密称取干燥恒重过80目筛的鸡菌粉末1000 0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL超纯水，称重，室温下超声（100 kHz）提取60 min后取出，以超纯水补足失重，提取液12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，使用时，稀释10倍，过022 μm微孔滤膜，供UFLCQTRAPMSMS分析。

25线性关系考察及检测限和定量限精密吸取23项下不同浓度系列对照品溶液及混合对照品储备液各2 μL，在21， 22项下色谱质谱条件测定，以对照品的峰面积（Y）对相应的质量浓度（X） 进行线性回归，得回归方程、相关系数和线性范围；按信噪S/N=3计算检测限（LOD），以S/N=10计算定量限，见表2，图1。

26方法学考察精密度试验：精密吸取一定浓度的混合对照品溶液，连续进样6次，测定各对照品峰面积，15种氨基酸和12种核苷对照品的峰面积相对标准偏差见表3。

重复性试验：精密称取S2灰鸡菌样品6份，每份1000 0 g，分别按24项下方法制备供试液，进样测定，15种氨基酸和12种核苷类成分的含量相对标准偏差见表3。

稳定性试验：取S2灰鸡菌样品供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h进样分析，15种氨基酸和12种核苷类成分峰面积的相对标准偏差见表3。

加样回收率试验： 精密称取已知含量S2灰鸡菌样品1000 0 g，分别精密加入高、中、低3 个水平的对照品适量，每个水平3份，共9份，按24项下方法制备加样回收供试品溶液，并按样品测定方法进行测定，计算回收率及相对标准偏差（RSD），

27样品测定将供试品溶液2 μL注入液相色谱质谱联用仪中，在21，22项下色谱质谱条件测定，根据线性关系计算样品中15种氨基酸和12种核苷类成分的含量。结果见表4，图2。

28PCA分析主成分分析（PCA）是一种降维或者把多个指标转化为少数几个综合指标的一种多元数理统计方法。本次研究将蚁巢伞属3种鸡的15种氨基酸含量和12中核苷含量分别应用SPSS 220分析软件进行主成分分析，数据经标准化处理后进行PCA。以特征值大于1，累积贡献率大于70%为提取标准，累积贡献率越大，可靠性越大。氨基酸和核苷分别得到2个主成分，见表5，其中氨基酸中前2个主成分累计贡献率达到100%，核苷中前2个主成分累计贡献率也达到100%，均都大于70%，说明前2个因子在反映不同品种蚁巢伞属鸡的内在质量起着主导作用，能客观反应不同品种蚁巢伞属鸡的内在质量，因此选前2个主成分进行分析。

因子载荷矩阵主要说明主成分在各变量上的载荷，载荷越高，越相关，见表6。在氨基酸中，谷氨酸、赖氨酸、组氨酸在PC1上有较高的载荷，说明PC1主要反映了谷氨酸、赖氨酸、组氨酸的信息；同理，PC2主要反映天冬氨酸、酪氨酸的信息。同理，在核苷中，PC1主要反映尿嘧啶、鸟嘌呤、尿苷、鸟苷的信息；PC2主要反应腺嘌呤、2′脱氧胞苷、胸苷的信息。前2个主成分基本包含了大部分成分的信息。

采用2个主成分对蚁巢伞属3种鸡进行质量评价。以各主成分因子得分与方差贡献率乘积之和相加，得出各何首乌加工品中各类成分总因子得分值F，以得分值F的大小评价各加工的优劣。

氨基酸线性组合表达式F=F1×0584 38+F2×0415 62；核苷线性组合表达式F=F1×0

其中F为综合得分，F1为第1个主成分，F2为第2个主成分，F3 为第3主成分。根据主成分的表达式可以计算出蚁巢伞属3种鸡综合得分排序，见表7。由综合得分可知，在氨基酸中S1，即鸡得分最高，S2，即灰鸡次之。在核苷中，S1，即鸡得分最高，S2，即灰鸡次之。

3讨论

31色谱质谱条件的优化查阅相关文献[2022]，大都采用甲醇、乙腈作為有机相，且氨基酸和核苷类成分大多溶于水，偏碱性，因此选取了甲醇01%磷酸水溶液、甲醇5 mmol·L-1醋酸铵（含01% 冰醋酸）、 01%的甲酸水乙腈、02%甲酸水02%甲酸乙腈。结果表明，乙腈分离效果比甲醇好，且在水和乙腈中同时加入02%的甲酸可改善峰形，减少色谱峰拖尾，峰形较好，分离度高。因此本实验采用02%甲酸水02%甲酸乙腈为流动相。

32供试品制备方法的优化查阅相关文献[2325]，实验中对提取溶剂（水、70%甲醇）、液料比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40）、提取方法（回流、超声）及提取时间（20，40，60，80 min）进行了单因素考察。结果表明，以水为提取溶剂，液料比为1∶20，超声提取60 min，能提出更多的待测物。因此选择以水为溶剂，液料比1∶20，超声提取60 min。

33结果分析本实验结果见图2，由图2可知，蚁巢伞属3种鸡中氨基酸总含量差异较大，且S1>S2>S3；核苷总含量差异较氨基酸来说较小，

不过含量同样是S1>S2>S3。由表4可知，各品种中氨基酸和核苷类成分含量差异较大，蚁巢伞属3种鸡中氨基酸类成分中，以丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸为主要成分，其中缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸为人体内必需氨基酸。同理，在核苷类成分中，尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟嘌呤、尿苷、鸟苷为主要成分。

结合PCA主成分分析综合评价，可知，在氨基酸中S1，即鸡得分最高，S2，即灰鸡次之，因此，若以氨基酸为评价指标，则S1质量最为好。同理，在核苷中，S1，即鸡得分最高，S2，即灰鸡次之，则以核苷为评价指标，S1质量最好。

本实验建立了UFLCQTRAPMSMS同时测定蚁巢伞属3种鸡中15种氨基酸和12种核苷的含量，比较了不同品种鸡中含量的差异，并通过PCA主成分分析进行综合评价，为进一步探索评价蚁巢伞属鸡中内在质量及控制提供依据，同时为扩大药用菌物资源提供借鉴。

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