延龄草与吉林延龄草根茎及须根中3种皂苷成分的含量测定

杨印军+孙欣光+杨杰+李齐+张洁+赵阳+马百平+郭宝林

[摘要]比较延龄草与吉林延龄草药材根茎与须根间主要成分的含量差异，利用HPLCCAD同时测定了3种主要成分重楼皂苷Ⅶ、偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ的含量。色谱条件：TSK gel ODS（46 mm×250 mm， 5 μm）色谱柱，乙腈水（43∶57）等度洗脱，流速为1 mL·min-1，进样量为20 μL。电雾式检测器（CAD）：工作气压为35 psi（1 psi=6895 kPa），雾化器温度为35 ℃。3种甾体皂苷良好分离，线性关系、稳定性、精密度、重复性、加样回收试验均符合中药质量分析要求。运用IBM SPSS Statistics 20分析软件进行主成分分析，结果显示，头顶一颗珠的来源包含了2种延龄草属植物，且吉林延龄草为主要资源；7批延龄草样品和9批吉林延龄草的根茎之间3种皂苷成分的含量存在不显著差异；但是根茎与须根之间3种皂苷成分的含量存在显著的差异。

[关键词]HPLCCAD； 延龄草与吉林延龄草； 根茎与须根； 甾体皂苷； 含量测定； 主成分分析

[Abstract]To compare the differences of main components between in rhizoma and fibrous root of Trillium tschonoskii and T kamtschaticum， a simple， accurate and reliable high performance liquid chromatography coupled with the charged aerosol detector （HPLCCAD） method was developed and then successfully applied for simultaneous quantitative analysis of three compounds， including polyphyllin Ⅶ （T1），pennogenin 3OαLrhamnopyranosyl（1→2） [αLrhamnopyranosyl（1→4）]βDglucopyranoside （T2），polyphyllin Ⅵ （T3）， in 16 batches of rhizome and 14 batches of fibrous root The analytes were well separated from other constituents on TSK gel ODS （46 mm×250 mm， 5 μm） with acetonitrilewater （43∶57） at a flow rate of 10 mL·min-1 The injection volume was 20 μL The nitrogen inlet pressure for the CAD system was 35 psi and the nebulizer chamber temperature was 35 ℃The method was validated for linearity （r>0999 0）， intra and interday precision （029%30%）， repeatability （045%14%）， stability （19%26%）， recovery （1001%1002%， 12%18%）， limits of detection （0002 g·L-1）， and limits of quantification （0005 g·L-1）The obtained datasets were processed by principal component analysis （PCA） and it showed that there was almost no difference in rhizoma of T tschonoskii and T kamtschaticum from different areas of China However， the 3 major compounds existed in rhizoma were different from those in fibrous root of T tschonoskii and T kamtschaticum

[Key words]HPLCCAD； Trillium tschonoskii and Trillium kamtschaticum； rhizoma and fibrous root； steroid saponin； determination； principal component analysis （PCA）

延龄草为百合科延龄草属植物，全世界共有约50种，我国有3种，即延龄草Trillium tschonoskii Maxim、吉林延龄草T kamtschaticum Pall，分布于吉林、西藏延龄草T govanianum Wall（仅见于西藏卡马河下游）[1]。其中，延龄草T tschonoskii被《湖北省中药材标准》收录，药材名头顶一颗珠，又名芋儿七、佛手七、狮儿七等，药用部位为根及根茎。其味甘、性平、有小毒，有延年益寿的功效，主治头晕目眩、跌打损伤、神经衰弱、高血压病和脑震荡后遗症等疾病，为土家族常用药材[23]。本课题组在进行头顶一颗珠的产地和市场资源调查时发现，目前河北安国、安徽亳州、四川成都和广西玉林等药材市场流通的头顶一颗珠药材均为来自吉林的吉林延龄草，安徽亳州市场的药材也以黑龙江产為主，中药材天地网诚实通平台销售的头顶一颗珠也是吉林延龄草，表明头顶一颗珠药材的来源值得研究。

延龄草中主要的化学成分为甾体皂苷，黄酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷等[4]，目前已有延龄草药材中总皂苷及主要甾体皂苷成分含量测定的研究报道[56]，但迄今为止尚未有吉林延龄草的质量研究和相关报道。本研究利用HPLCCAD测定2种延龄草药用部位（根状茎和须根）中重楼皂苷Ⅶ、偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ等3种主要皂苷的含量，其中重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷Ⅵ也是重楼中的重要活性成分[78]。同时，利用统计学方法分析几个重要产区的延龄草与吉林延龄草之间及根茎与须根之间化学成分的差异，为延龄草属药材合理利用及质量评价提供了科学依据。

1材料

11实验样品

药材来源信息见表1，经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林研究员鉴定为百合科延龄草属植物延龄草T tschonoskii和吉林延龄草T kamtschaticum，对1份样品中同时有根状茎和须根的，分开2个部位测定。

12药品及试剂

对照品重楼皂苷Ⅶ（T1），偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖（T2）、重楼皂苷Ⅵ（T3）均为本课题组从延龄草中分离得到，HPLC面积归一化法测得纯度均≥98%。

乙腈（色谱纯）购于美国Fisher公司；蒸馏水购于广州屈臣氏有限公司。

13主要仪器

Waters 2695分析型高效液相色谱（Empower工作站），配置有Waters 2487 DAD检测器，ELSD检测器（2000ES，Alltech，USA），CAD检测器（Corona Ultra，Thermo Fisher，USA）；TP 600超声波清洗机（天鹏电子新技术有限公司）；BP 211D 1/10万天平（德国Sartorius公司）。

2方法与结果

21对照品溶液制备

分别精密称取3种对照品各1250 mg于5 mL量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，即得250 g·L-1的各對照品储备液，并按照T1T2T3（1∶2∶2）配制成含T1，T2，T3分别为05，100，100 g·L-1的混合对照品储备液。

22供试品溶液制备

精确称取干燥药材粉末（过40目筛）05 g于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇溶液，称重，浸泡30 min，常温下超声提取（功率500 W，频率40 kHz）40 min，放冷，用80%甲醇溶液补足失重，摇匀，022 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

23色谱条件

色谱柱TOSOH TSKgel ODS100V （46 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈水（43∶57），等度洗脱15 min；流速10 mL·min-1；电雾式检测器（CAD）工作气压35 psi（1 psi=6895 kPa）、雾化器温度35 ℃；进样量20 μL。色谱图如下图1。

24方法学考察

241线性关系精密吸取各混合对照品储备液25，50，100，250，500，750，1 000 μL分别置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的混合标准品溶液。按照23项下条件进样20 μL测定，以峰面积（Y）对对照品浓度（X，mg·L-1）进行线性回归，得各对照品回归方程、相关系数及线性范围。以信噪比S/N=3为基准，测得最低检测限，以信噪比S/N=10为基准，测得最小定量限，结果见表2。

242精密度试验精密吸取对照品溶液按23项下色谱条件，于同1 d内连续进样6次，记录峰面积。结果显示，对照品重楼皂苷Ⅶ，偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ的日内峰面积 RSD分别为062%，041%，029%；连续3 d内每天连续进样6次，测得日间峰面积RSD分别为30%，18%，21%，表明仪器精密度良好。

243重复性试验取样品粉末（JR1）6份，分别按22项下方法制备供试品溶液，按23项下色谱方法测定，计算样品中重楼皂苷Ⅶ，偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ含量的RSD分别为14%，045%，058%，结果表明实验重复性良好。

244稳定性试验取同一份供试品溶液（JR1），分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定。计算重楼皂苷Ⅶ，偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ峰面积的RSD分别为26%，19%，19%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

245加样回收率试验取已知含量的供试品粉末（JR1）9份，每份各约 025 g，精密称定，分别置于50 mL离心管中，精密加入含T1，T2，T3分别为15，55，62 g·L-1的混合标准溶液800，1 000，1 200 μL，按照21项下方法平行制备，23项下色谱方法测定，测得T1，T2，T3的平均回收率见表3，结果表明该方法的准确性良好。

25样品的含量测定

样品测定结果见表4。结果显示延龄草及吉林延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ、偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ的量为451～1357，1228～3347，1452～4006 mg·g-1；延龄草及吉林延龄草须根中重楼皂苷Ⅶ的量为587～1825 mg·g-1，而偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖和重楼皂苷Ⅵ在本实验条件下仅可在部分须根样品检测到。

26结果分析

以延龄草及吉林延龄草根茎中3种甾体皂苷的含量为基础，采用IBM SPSS Statistics 20分析软件进行主成分分析，制成散点图，见图2。同样地，以延龄草及吉林延龄草根茎和须根中3种甾体皂苷的含量为基础，采用该分析软件进行主成分分析，结果见图3。图2中不同产地延龄草及吉林延龄草根茎各样本互相混杂分布，说明二者之间无明显差异。其中陕西产一份延龄草样品（YR5）未检测到重楼皂苷Ⅵ，而黑龙江产吉林延龄草（JR4）中重楼皂苷Ⅵ含量非常高，从而与其余样品差异较明显。图3结果可见，根茎样本与须根样本可以基本分为2类，

不同部位之间差异比较显著。

3讨论

31样品提取条件的优化

样品提取过程中考察了超声提取法和加热回流提取法，通过比较3种待测成分的峰面积发现，二者提取效果相当，故选择操作简便、快速的超声提取法。超声提取法中，分别考察了提取溶剂（60%甲醇、80%甲醇、无水甲醇、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇）、提取物料比（1∶25，1∶50，1∶75，1∶100）、提取时间（20，40，60 min）对待测成分提取率的影响。最终优化的提取条件为80%甲醇作提取溶剂，提取物料比为1∶100，超声提取40 min。

32检测器的选择

甾体皂苷一般用蒸发光散射检测器（ELSD）

作为通用型检测器，但其灵敏度较低。电雾式检测器（CAD）同样作为通用型检测器，且具有较高的灵敏度正得到广泛使用[910]。文献报道[6，11]，待测3种甾体皂苷在203 nm下有紫外吸收，本实验考察了DAD，ELSD及CAD 3种检测器的灵敏度，检测限依次为032，021，004 μg，定量下限依次为056，038，010 μg。所以，本文选择了灵敏度高的CAD检测器。

33延龄草和吉林延龄草药材比较

延龄草和吉林延龄草植物形态区别明显，但药用部位为根茎和须根的头顶一颗珠药材难以从形态上区分和确定来源物种，《中华本草》记录的头顶一颗珠也是来源于这2个物种，药材形态也未加区分[12]。《中国植物志》记载延龄草T tschonoskii分布于云南、四川、湖北、安徽，陕西的秦岭以南，吉林延龄草T kamtschaticum分布于吉林，地理分布上是完全不同的。为了进一步找到区别二者的方法，本研究组尝试了DNA条形码鉴定方法，依据ITS2序列无法区分二者。因此本文从来源分布上初步认定延龄草和吉林延龄草样品（部分来自于市场的样品则与销售商认真沟通确认了来源的产地）。本文实际的调查发现，由于延龄草分布局限于1 600 m以上的高海拔地区，在湖北和重庆更是要2 000 m以上才生长，资源量很稀少，而吉林延龄草资源较多，所以头顶一颗珠可能一直是以吉林延龄草为主流的。从本文测定的16份样品中3种主要皂苷成分的含量上看，二者没有差别，建议湖北省藥材标准修订时增加来源物种为2个种。

34延龄草根茎和须根的成分含量比较

2种延龄草的根茎与须根的比较结果显示，二者存在较大差异。在15批（除YR5）根茎样品中，所测3种成分均存在，其中偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ的含量均比重楼皂苷Ⅶ高，分别是重楼皂苷Ⅶ含量的226～412倍、289～480倍。但在14批须根样品中均未检测到重楼皂苷Ⅵ，仅有5批样品同时检测到重楼皂苷Ⅶ和偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖。并且14批须根样品中，重楼皂苷Ⅶ的含量均最高，其中11批高于同批次根茎中的含量，是根茎中的含量145～253倍。同时发现重楼相关研究中也有报道，重楼须根中重楼皂苷Ⅶ的含量明显高于根茎中的含量[13]。湖北省药材标准中规定的药材来自于根和根茎，但是本文收集的样品中有2份是仅有根茎而无须根的，因2个部位的成分构成上存在差异，建议应有所区别。

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