基于质量源于设计理念的金银花水提液石灰乳沉淀工艺优化研究

沈金晶+龚行楚+潘坚扬+瞿海斌

[摘要]该研究采用设计空间法优化金银花水提液的石灰乳沉淀工艺。该工艺的评价指标为6种有机酸总纯度和单位质量药材提取出的6种有机酸量。通过加权标准偏回归系数法筛选出碱液滴加速度、调碱pH、静置时间和静置温度为4个关键工艺参数。采用逐步回归法建立工艺评价指标与关键工艺参数的定量模型。通过Monte Carlo算法计算出基于概率的设计空间并进行验证。结果表明，在设计空间内操作能够保证石灰乳沉淀工艺品质稳定。该研究推荐石灰乳沉淀工艺操作空间为：碱液滴加速度100～125 mL·min-1，调碱pH 115～117，静置时间10～11 h，静置温度100～200 ℃。

[关键词]金银花； 石硫醇法； 石灰乳沉淀； 质量源于设计； 设计空间

[Abstract]Design space approach was applied in this study to optimize the lime milk precipitation process of Lonicera Japonica （Jinyinhua） aqueous extract The evaluation indices for this process were total organic acid purity and amounts of 6 organic acids obtained from per unit mass of medicinal materials Four critical process parameters （CPPs） including drop speed of lime milk， pH value after adding lime milk， settling time and settling temperature were identified by using the weighted standardized partial regression coefficient method Quantitative models between process evaluation indices and CPPs were established by a stepwise regression analysis A design space was calculated by a MonteCarlo simulation method， and then verified The verification test results showed that the operation within the design space can guarantee the stability of the lime milk precipitation process The recommended normal operation space is as follows： drop speed of lime milk of 100125 mL·min-1， pH value of 115117， settling time of 1012 h， and settling temperature of 1020 ℃

[Key words]Lonicera Japonica； lime milksulfuric acidethanol method； lime milk precipitation process； quality by design； design space

金银花Lonicera japonica Thunb为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、疏散风热之功效[1]。金银花提取物可用于制备痰热清注射液和茵栀黄胶囊等多种中药，其质量控制常采用包含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C等酚酸类成分的含测方法和特征图谱[2]。

金银花提取物制备过程常采用石硫醇法。石硫醇法分为石灰乳沉淀和硫酸溶解2个过程，先向金银花水提液中加入石灰乳，使有机酸形成钙盐沉淀，过滤收集沉淀；随后加入乙醇使沉淀混悬，再加硫酸使有机酸溶出，得到有机酸的醇溶液和硫酸钙沉淀。该法操作简单，自20世纪70年代起就已用于注射液的生产[3]，但该法有机酸收率较低，批次间一致性差，已有文献报道中也缺乏系统的工艺研究。

近年来，质量源于设计（quality by design，QbD）理念在制药领域获得了日益广泛的关注和应用。该理念强调对药品及其生产工艺的理解，要求采用知识管理和风险管理，依靠原料质控和生产过程质控来控制药品质量。QbD理念实施时常采用设计空间法（design space approach），该法能够提供稳健生产的工艺参数范围，确保产品质量的一致性，目前已用于提取、醇沉、水沉和柱色谱等工艺的参数优化[410]。

本研究基于QbD理念，采用設计空间法优化金银花水提液石灰乳沉淀工艺，以加权标准偏回归系数法筛选关键工艺参数[11]，建立工艺评价指标和关键工艺参数的定量模型，利用Monte Carlo算法获得基于概率的设计空间并进行验证。

1材料

pH计（S40 SevenMulti，瑞士MettlerToledo公司）；低温恒温槽（THD1008W，宁波天恒仪器厂）；旋转蒸发仪（R200，德国BUCHI公司）；恒温水浴槽（B490，德国BUCHI公司）；注射泵（LSP021B，保定兰格恒流泵有限公司）；数显测速电动搅拌器（JJ1A，常州润华电器有限公司）；磁力搅拌器（851，杭州仪表电机有限公司）；精密电子天平（XS105 DualRange，瑞士MettlerToledo公司）；电热恒温鼓风干燥器（DHG9146A，上海精宏实验设备有限公司）；高效液相色谱仪（1260，德国Agilent公司），配四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、OpenLAB ChemStation工作站。

金银花药材由上海凯宝药业股份有限公司提供（产地河南封丘县，批号160302）；用于标准曲线配置的新绿原酸对照品（纯度>99%，140106），绿原酸对照品（纯度>99%，140311），隐绿原酸对照品（纯度>99%，140224），咖啡酸对照品（纯度>99%，140219），异绿原酸B对照品（纯度>99%，140309），异绿原酸A对照品（纯度>99%，140221），异绿原酸C对照品（纯度>99%，130428）均购自上海融禾医药科技有限公司；用于加样回收样品配置的新绿原酸对照品（纯度>99%，160904），绿原酸对照品（纯度>99%，160927），隐绿原酸对照品（纯度>99%，160917），咖啡酸对照品（纯度>99%，161021），异绿原酸B对照品（纯度>99%，160925）；异绿原酸A对照品（纯度>98%，161026），异绿原酸C对照品（纯度>98%，161020）均购自上海融禾医药科技有限公司；氢氧化钙（分析纯，建德市新安江重钙厂）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；色谱纯乙腈、甲醇均购自Merck公司；去离子水由水超纯水系统（MilliQ，德国Millipore公司），每日新制。

2方法

21金银花水提浓缩液制备及石灰乳沉淀步骤

称取150 g金银花药材，分别加225 L水和150 L水煎煮2次，第1次煎煮1 h，第2次煎煮05 h，滤过，合并滤液，将滤液浓缩至450 mL，冷冻储存备用。

用磁力搅拌器在冰浴条件下配置一定浓度石灰乳，配完后继续搅拌备用。浓缩液在常温下解冻后摇匀，量取约100 mL至250 mL烧杯中，在机械搅拌下用注射泵以一恒定速度滴加石灰乳，加完后继续搅拌30 min，再将烧杯用保鲜膜密封，在低温恒温槽中静置一定时间。将烧杯取出后立即抽滤，收集沉淀后称重。取部分沉淀分析有机酸含量及固含量，其余冷冻保存。

22分析方法及方法学验证

沉淀和浓缩液中有机酸含量采用HPLC测定[12]。沉淀样品的前处理方法如下：取钙盐沉淀约12 g，用50 mL乙醇混悬，加入6%的盐酸溶液将pH调至10，使钙盐沉淀基本溶解，抽滤，取5 mL滤液浓缩至干，用50%甲醇溶解并定容至10 mL量瓶，进行HPLC分析。

HPLC分析条件：色谱柱为Agilent Zorbax SBC18柱（46 mm×250 mm，5 μm）；以01%甲酸水溶液为流动相A，01%甲酸乙腈溶液为流动相B，进行梯度洗脱，0～25 min，8%B，25～30 min，8%～19%B，30～60 min，19%B，60～61 min，19～90%B，61～65 min，90%B；检测波长325 nm；流速1 mL·min-1；进样量10 μL；柱温25 ℃。

对照品溶液配制方法如下：精密称取新绿原酸对照品508 mg，绿原酸对照品563 mg，隐绿原酸对照品 494 mg，咖啡酸对照品1172 mg，异绿原酸B 对照品489 mg，异绿原酸A对照品 491 mg，异绿原酸C对照品 487 mg，以50%甲醇超声溶解并定容至5 mL量瓶，作为标准曲线最高浓度溶液，逐步稀释至标准曲线各浓度溶液。

加样回收率样品制备方法：精密称取新绿原酸对照品379 mg，绿原酸对照品3561 mg，隐绿原酸对照品698 mg，咖啡酸对照品045 mg，异绿原酸B 对照品674 mg，异绿原酸A对照品806 mg，异绿原酸C对照品947 mg，以50% 甲醇超声溶解并定容至25 mL量瓶，作为加样回收对照品储备液。取金银花提取液1 mL，共9份，精密称定，分别加入06，10，14 mL加样回收对照品储配液，以50%甲醇超声溶解并定容至5 mL，配成80%，100%，120%浓度的加样回收样品，每个浓度样品平行制备3份，进行HPLC分析。

总固体含量测定采用质量法[13]。取钙盐沉淀约2 g或浓缩液约05 mL，精密称量，然后置于已恒重的称量瓶内，在鼓风干燥箱内105 ℃干燥3 h，放入干燥器内冷却至室温，再次称量。根据样品干燥后质量计算样品中总固体含量。

23试验设计

231工艺评价指标为考察金银花水提液中的有机酸转移到钙盐沉淀情况，将每1 g药材提取出的新绿原酸量（Y1）、绿原酸量（Y2）、隐绿原酸量（Y3）、异绿原酸B量（Y4）、异绿原酸A量（Y5）、异绿原酸C量（Y6）作为工艺评价指标。

同时，为考察金银花水提液中杂质除去程度，将以上6种有机酸的总纯度（Y7）也作为工艺评价指标，计算公式如下。总有机酸纯度=样品中6种有机酸总量1样品总固体量×100%（1）232关键工艺参数筛选采用PlackettBurman设计考察碱液滴加速度、調碱pH、调碱搅拌速度、石灰乳质量浓度、石灰乳搅拌速度、静置时间、静置温度等7个工艺参数对金银花石灰乳沉淀过程的影响，各因素和相应水平见表1，具体条件见表2。试验设计由JMP11（美国SAS公司）完成。

33石灰乳沉淀工艺建模采用BoxBehnken设计研究石灰乳沉淀过程关键工艺参数和工艺评价指标的定量关系。调碱搅拌速度固定为400 r·min-1，石灰乳浓度固定为20%，石灰乳搅拌速度固定为450 r·min-1。其他参数见表3，试验设计由Design Expert 806（美国StatEase公司）完成。

其中a0，k为常数项，xi为工艺参数编码值，为参数Xi对指标Yk的标准偏回归系数。然后将各标准偏回归系数的绝对值加权求和。作者认为单位质量药材提取出的有机酸量和总有机酸纯度同等重要，各占1/2权重，因此加权标准偏回归系数绝对值之和采用下式计算。

Axi=1112×6k=1|axi，k|+112×axi，7（4）

其中为参数Xi对7个工艺评价指标的偏回归系数加权之和，取加和值较大的前4项对应的参数作为关键工艺参数。

关键工艺参数与工艺评价指标之间的数学模型采用下式计算。

Y=b0+4i=1bixi+4j=1bjx2j+3i=14j=i+1bijXiXj（5）

其中，b0为常数项，bi，bj，bij为偏回归系数。采用逐步回归法简化方程，模型移入或移除特定项的P设定为010。多元线性回归和逐步回归均采用DesignExpert806（美国StatEase公司）计算。

采用模拟重复试验结果的Monte Carlo法计算设计空间[7，9]，由MatlabR2014a（美国MathWorks公司）自编程序进行计算。假设在某特定工艺条件下，多次重复试验所得工艺评价指标的值符合正态分布，其平均值与试验结果相同，相对标准偏差根据中心点相对标准偏差确定。计算时随机模拟各指标的值，通过逐步回归法建模并预测，统计不同工艺参数组合下预测结果的达标情况，取达标概率大于或等于080的组合为设计空间。计算中將关键工艺参数变化步长设为002，模拟次数为15 000次。

3结果与讨论

31有机酸含量测定分析方法学验证

根据本研究样品的实际情况，对文献[12]方法进行方法学验证，标准曲线及线性范围考察结果见表4，加样回收考察结果见表5，对照品及提取液样品HPLC图见图1。各有机酸80%，100%，120%浓度的平均回收率在9770%～1062%，RSD均小于35%，证明该分析方法准确、可靠，可用于本研究中样品有机酸的含量测定。

32关键工艺参数筛选

PlackettBurman设计所得结果见表2。单位质量药材提取出的绿原酸量、异绿原酸B量、异绿原酸A量、异绿原酸C量分别为292～643，065～129，072～149，191～513 mg，与纯化前的181，149，370，540 mg相比均明显减少，说明这4种成分在纯化过程中损失较大。已有文献报道新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸在强碱性条件下易发生降解转化[1516]，所以推测有机酸损失主要原因为石灰乳加入后有机酸产生降解。总有机酸纯度在343%～706%，而浓缩液中为838%，也有明显下降。

公式（4）中各指标相应的模型标准偏回归系数及其绝对值之和值见表6。由表可知，碱液滴加速度（X1）、调碱pH（X2）、静置时间（X3）、静置温度（X4）的偏回归系数绝对值之和大于另外3项，因此认为它们是石灰乳沉淀过程关键工艺参数。

33关键工艺参数的影响规律

BoxBehnken设计所得结果见表3，并以公式

（5）建立工艺评价指标与关键工艺参数的定量模型。模型的偏回归系数及方差分析结果见表7。各模型的R2在080～088，说明模型能解释大部分变异。除异绿原酸C指标外，调碱pH对其他指标都有显著影响；静置时间对所有指标均有显著影响；除异绿原酸A和异绿原酸C指标外，静置温度对其他指标都有显著影响。除纯度外，碱液滴加速度和调碱pH的交互作用对其他指标均有显著影响；除新绿原酸和绿原酸指标外，静置时间和静置温度的交互作用对其他指标均有显著影响。

由于工艺参数对新绿原酸量、隐绿原酸量、异绿原酸B量、异绿原酸A量和异绿原酸C量的影响规律类似，因此以新绿原酸量为例进行说明。新绿原酸量等高线图见图2，结合偏回归系数的数值，见表7，可知：碱液滴加速度越快，调碱pH越低，静置时间越短，静置温度越低，新绿原酸量越高。

绿原酸量等高线图见图3，碱液滴加速度越快，调碱pH越高，静置时间越短，静置温度越低，绿原酸量越高。

纯度等高线图见图4，结合表7中偏回归系数的数值可知：调碱pH越低，静置时间越短，静置温度越低，总有机酸纯度越高。

静置时间1 h，静置温度20 ℃。

a静置时间1 h，静置温度20 ℃；b碱液滴加速度125 mL·min-1，静置温度20 ℃；c碱液滴加速度125 mL·min-1，静置时间1 h； d 碱液滴加速度125 mL·min-1，pH 120。

碱液滴加速度125 mL·min-1，pH 120。

34设计空间及验证

工艺评价指标的可接受范围及达标概率见表8。通过Monte Carlo算法计算得到设计空间，见图5。为便于操作，推荐设计空间内操作空间为：碱液滴加速度100～125 mL·min-1，调碱pH 115～117，静置时间10～11 h，静置温度100～200 ℃。该操作空间内工艺评价指标的最低达标概率为0800。

为验证设计空间的准确性，分别在设计空间内、外取一点进行验证，记为V1，V2。验证点实验条件及结果见图5，表9。由验证结果可知，实测值与预测值基本符合，证明模型预测性能良好。设计空间内验证点完全达标，而设计空间外验证点的总有机酸纯度和异绿原酸C量不能达标，说明在设计空间内操作能保证石灰乳沉淀工艺品质稳定可靠。

a碱液滴加速度为125 mL·min-1；bpH 115；c碱液滴加速度125 mL·min-1，静置温度20 ℃；△设计空间内验证点；×设计空间外验证点；彩条指所有指标均达标的概率值。

4结论

本研究通过设计空间法优化金银花水提液石灰乳沉淀工艺。首先确定工艺评价指标为纯度、单位

质量药材提取出的新绿原酸量、绿原酸量、隐绿原酸量、异绿原酸B量、异绿原酸A量和异绿原酸C量；随后，通过加权标准偏回归系数法筛选出碱液滴加速度、调碱pH、静置时间和静置温度为4个关键工艺参数；再采用逐步回归法建立工艺评价指标与关键工艺参数的定量模型；最后，通过Monte Carlo算法计算出基于概率的设计空间并验证。验证结果证明在该工艺参数设计空间内操作能够保障石灰乳沉淀过程质量稳定。为便于操作，推荐金银花水提液石灰乳沉淀工艺的操作空间为：碱液滴加速度100～125 mL·min-1，调碱pH 115～117，静置时间10～11 h，静置温度100～200 ℃。