鞘内注射米诺四环素对脊神经结扎大鼠神经病理性疼痛模型的镇痛效应

周于然+李瑛

[摘要] 目的 探讨脊髓小胶质细胞参与调解神经病理性疼痛的分子机制。 方法 成年雄性SD大鼠32只，随机分为4组，每组各8只。假手术（SO）组，暴露脊神经但不结扎；结扎L5/6脊神经（SNL）组；SNL+生理盐水（NS）组结扎L5/6脊神经，鞘内注射NS；SNL+米诺四环素（MI）组，结扎L5/6脊神经，鞘内注射MI。分别测量各组大鼠术前及术后2～7 d机械缩足阈值（MWT）和热痛缩足潜伏期（TWL）。SNL+NS組和SNL+MI组于术后7 d测量痛阈前30 min鞘内注射NS或MI。最后一次痛阈测量后，将大鼠处死取脊髓背角用ELISA法检测脊髓组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）表达水平。 结果 四组大鼠痛阈基础值差异无统计学意义（P > 0.05）。SNL组、SNL+NS组和SNL+MI组，术后2～6天MWT和TWL较SO组显著下降（P < 0.05）。与SNL组比较，鞘内注射NS对大鼠MWT和TWL无影响（P > 0.05）；鞘内注射MI显著升高大鼠MWT和TWL（P < 0.05）。SNL组脊髓背角TNF-α和IL-1β表达水平较SO组显著升高（P < 0.05）；SNL+NS组TNF-α和IL-1β表达水平明显高于SO组（P < 0.05），与SNL组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；SNL+MI组TNF-α和IL-1β表达水平与SO组比较差异无统计学意义（P > 0.05），明显低于SNL组（P < 0.05）。 结论 脊髓小胶质细胞参与调解SNL神经病理性疼痛，鞘内注射米诺四环素的镇痛效应可能与TNF-α、IL-1β密切相关。

[关键词] 小胶质细胞；神经病理性疼痛；米诺四环素；痛阈

[中图分类号] R614.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（b）-0016-04

[Abstract] Objective To discuss the molecular mechanisms of spinal cord microglia involving in modulating neuropathic pain. Methods 32 adult male SD rats were randomly divided into 4 groups， each group had 8 rats. Sham operation （SO） group： the spinal nerves were exposed but not ligated； spinal nerves ligated （SNL） group： the L5/6 spinal nerves were exposed and ligated； SNL+ normal saline （SNL+NS） group： after SNL neuropathic pain model prepared， rats were received intrathecal injection of NS； SNL+Minocycline（MI） group： after SNL neuropathic pain model prepared， rats were received intrathecal injection of MI. The thermal withdrawal latency（TWL） and mechanical withdrawal threshold （MWT） were measured before operation and on the 2-7th d after operation. NS or MI was given at 30 min before measuring pain thresholds on the 7th day after SNL. At the end of the last measuring pain thresholds， rats were sacrificed and the dorsal horn of spinal cords were sampled to detect the expression level of TNF-α and IL-1β by ELISA. Results There was no significant difference in the baseline of pain threshold among rats in 4 groups （P > 0.05）. TWL and MWT in SNL group， SNL+NS group and SNL+ MI group were significantly lower than those in the SO group on 2-6 d after operation （P < 0.05）. Compared to SNL group， intrathecal injection of NS had no effect on MWT and TWL （P > 0.05）； intrathecal injection of MI significantly increased the levels of MWT and TWL in rats （P < 0.05）. The expression levels of TNF-α and IL-1β in the dorsal horn of spinal cords in SNL group were significantly higher than those in SO group （P < 0.05）. The expression levels of TNF-α and IL-1β in SNL+NS group were significantly higher than those in SO group （P < 0.05）， and there was no significant difference between the SNL group and SNL+NS group （P > 0.05）. The expression levels of TNF-α and IL-1β in SNL+MI group were not significantly different from those in SO group （P > 0.05）， and they were significantly lower than those in SNL group （P < 0.05）. Conclusion Spinal microglia is involved in mediating SNL neuropathic pain. The analgesic effect of intrathecal injection of Minocycline may be closely related to TNF-α and IL-1β.

[Key words] Microglia； Neuropathic pain； Minocycline； Pain threshold

神经病理性疼痛通常由神经损伤或疾病引起，病程持续较长，对止痛药不敏感，严重影响患者生活质量[1]。小胶质细胞是定居在中枢神经系统内的巨噬细胞，来源于卵黄囊原始巨噬细胞[2]。研究表明，外周神经损伤可以激活脊髓背角小胶质细胞[3]。外周神经损伤后脊髓背根神经节细胞金属蛋白酶-9（MMP-9）表达显著增加，且鞘内注射MMP-9可以激活小胶质细胞[4]。MMP-9激活小胶质细胞的物质基础仍不清楚，白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可能与之有关[5]。尽管研究表明脊髓小胶质细胞可能参与调解神经病理性疼痛，但具体机制有待阐明。本研究拟通过鞘内注射小胶质细胞特异性抑制剂米诺四环素（minocycline，MI）观察其对神经病理性疼痛模型大鼠痛阈及脊髓背角TNF-α和IL-1β表达的影响，从而明确脊髓小胶质细胞调解神经病理性疼痛的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器

米诺四环素（Sigma，美国），多聚甲醛（天津市大茂化学试剂厂），水合氯醛（成都科龙化工试剂厂），TNF-α、IL-1β试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），BME-410C型全自动热痛刺激仪（北京凯辉盛达科技发展有限公司），Electronic Von Frey测痛仪（美国IITC公司），高速离心机（美国Thermo公司）。

1.2 实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠32只，SPF级，体重（250±20）g，由第三军医大学动物实验中心提供（许可证号：SCXK（渝）2012-0005）。所有与动物饲养和操作都遵循国际动物保护协会和国际疼痛研究学会组织的相关规定，并获得遵义医学院实验动物伦理委员会批准。采用随机数字表将大鼠分为四组：假手术（sham opration，SO）组，仅暴露大鼠脊神经，但不进行结扎；结扎L5/6脊神经（spinal nerves ligated，SNL）组，暴露并结扎大鼠L5/6脊神经；SNL+生理盐水（normal saline，NS）组，结扎大鼠L5/6脊神经术后第7天鞘内注射NS；SNL+米诺四环素（Minocycline，MI）组，结扎大鼠L5/6脊神经术后第7天鞘内注射米诺四环素。

1.3 SNL神经病理性疼痛模型建立

10%水合氯醛50 mg/kg腹腔麻醉后，剔除大鼠背部毛发，2%碘酒和75%酒精消毒。做L3～S2背部正中切口，分离脊柱旁肌肉，暴露并咬断L6脊椎横突，分离L5/6脊神经，用5-0丝线结扎L5/6脊神经背根神经节的远端，最后缝合切口并消毒。SO组大鼠显露脊神经，但不用丝线结扎。

1.4 鞘内给药

将大鼠置于俯卧位，腹部垫一圆柱形物体，脊柱下段可探及一钝形突起即为髋结节[6]，其两侧水平连线位置即为L6棘突。用10 μL微量注射器连接30G针头，经L5～L6间隙缓慢垂直进针，大鼠出现S型甩尾或尾部颤动表示穿刺成功[7]，即可缓慢注射药物。SNL模型建立后7 d，SNL+NS组和SNL+MI组于痛阈测定前30 min分别鞘内注射NS或MI（5 g/L）20 μL。

1.5 痛阈测定

机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）：将大鼠置于一透明底部均匀分布大小0.5 cm×0.5 cm孔径的玻璃笼中，30 min后使用von Frey测痛仪垂直刺激大鼠左后肢足掌部，刺激力度以von Frey丝轻微弯曲为准，持续5 s或直至出现缩足反应。若出现缩足反应记为阳性，否则视为阴性。采用up-and-down法[8]计算50% MWT。MWT=最大值-（最大值-最小值）/[最大值×（最大百分比-50%）]。测定时间为SNL疼痛模型建立术前和术后2～7 d，每天08∶00～10∶00。

熱缩足潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）：大鼠适应30 min后，使用热痛刺激仪，辐射热对准小鼠左足掌正中照射，自动记录缩足反应的潜伏期作为热痛阈。持续时间为20 s，以免造成足底损伤。每只大鼠测定3次，取3次平均值作为TWL。测定时间为SNL疼痛模型建立术前和术后2～7 d，每天15∶00～17∶00。

1.6 脊髓背角取材及TNF-α、IL-1β含量测定

最后一次痛阈测定结束后，戊巴比妥钠（60 mg/kg）腹腔麻醉，用剪刀截取椎体腰段部分，从椎管注射冰冷生理盐水将脊髓冲出。用刀片切取腰膨大部（相当于L4～L6脊髓）并截取背角，放入-80℃冰箱冻存。

检测前将脊髓背角取出称质量，然后将其置于预冷组织匀浆液中。匀浆液由0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）和1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）组成，pH=7.4。使用玻璃匀浆器在4℃下组织匀浆，并使用离心机20 000 r/min离心30 min，取上清液。按照酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒提供的标准步骤测定肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL）-1β水平。所有组织标本均进行双管检测，结果以“pg/mg”表示。

1.7 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；同组不同时间点比较采用重复测量的方差分析；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组痛阈比较

四组大鼠痛阈基础值差异无统计学意义（P > 0.05）。SNL组、SNL+NS组和SNL+MI组，术后2～6 d MWT和TWL较OS组和术前均显著下降（P < 0.05）。术后7 d，SNL+NS组MWT和TWL明显低于SO组（P < 0.05），与SNL组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；SNL+MI组MWT和TWL值低于SO组（P < 0.05），高于SNL组（P < 0.05）。见表1、2。

2.2 四组TNF-α和IL-1β含量比较

SNL组TNF-α和IL-1β水平高于SO组，差异有统计学意义（P < 0.05）；SNL+NS组TNF-α和IL-1β水平高于SO组（P < 0.05），与SNL组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；而SNL+MI组TNF-α和IL-1β水平与SO组比较差异无统计学意义（P > 0.05），明显低于SNL组（P < 0.05）。见图1。

3 讨论

神经病理性疼痛，常发生于神经损伤或某些疾病之后，如癌症引起的骨压缩、自身免疫性疾、糖尿病等，神经病理性疼痛不仅是疾病的一个症状，更可能是神经系统功能紊乱所导致的结果[9]。

大鼠疼痛模型是研究神经病理性疼痛发病机制的常用动物模型。SNL神经病理性疼痛模型主要用于模拟灼性神经痛，表现为痛觉过敏或超敏，疼痛可持续4个月以上，有自发性疼痛行为，但无自残表现，其主要优点是产生的疼痛反应差异性较小[10]。Bai等[11]研究发现，SNL术后1 d大鼠TWL较术前明显下降。本研究SNL组、SNL+NS组和SNL+MI组SNL术后2 d较术前MWT和TWL均显著下降，表明SNL模型建立成功。此外，SNL组、SNL+NS组、SNL+MI组大鼠2～6 d MWT和TWL无明显差异，说明SNL模型疼痛反应差异性较小，是较为可靠的动物疼痛模型。

周围神经损伤引起的痛觉超敏不单是神经元变化导致结果，更可能是胶质细胞多重改变引起的，比如中枢神经系统的免疫细胞-小胶质细胞[12]。小胶质细胞是中枢神经系统内主要的免疫细胞，对病理性侵袭可迅速做出反应[13]。病理性疼痛或外周神经损伤均可激活小胶质细胞，主要表现为胞体肥大增厚、细胞数目增多、特异性标记物染色如CD11b加深等[14]。本研究鞘内注射MI减轻了SNL引起的痛阈升高，表明小胶质细胞参与了该过程。Wang等[15]研究也证实SNL模型大鼠脊髓背角小胶质细胞被激活。

在神经病理性疼痛持续和慢性化过程中，中枢敏化发挥着重要作用[16]。中枢敏化过程主要表现为胶质细胞激活，IL-1β、IL-6、TNF-α和前列腺素等释放增加，而胶质细胞释放的细胞因子可引起突触前囊泡释放致痛物质[17]。有研究证实，脊髓TNF-α mRNA和其蛋白在神经损伤早期迅速增高[18]。外周神经损伤后IL-1β mRNA和其蛋白水平也显著增加[19]。因此，TNF-α与IL-1β与神经病理性疼痛的发生和维持关系密切。本研究采用ELISA法检测脊髓背角TNF-α与IL-1β表达水平，结果显示：SNL组大鼠脊髓背角TNF-α与IL-1β表达水平显著高于SO组，也进一步证实了TNF-α与IL-1β参与了SNL神经病理性疼痛的发生和维持。鞘内注射MI明显降低了TNF-α与IL-1β的表达水平，表明小胶质细胞与SNL导致的TNF-α与IL-1β表达水平增高有关。另外一项研究也证实了鞘内注射MI可以逆转坐骨神经损伤疼痛模型大鼠注射强啡肽引起的IL-1β和IL-6升高[20]。因此，鞘内注射MI缓解SNL引起的痛阈降低可能与其降低脊髓背角IL-1β和TNF-α水平有关。由此可见小胶质细胞在神经病理性疼痛发生和维持过程中发挥着关键作用。

本研究具有以下几点不足之处：首先，SNL引起大鼠痛阈明显下降可能和脊髓小胶质细胞激活有关，但本研究没有利用免疫学技术证实脊髓小胶质细胞的激活状态。其次，本研究鞘内注射MI可以缓解SNL模型大鼠的疼痛程度，但没有完全逆转，表明除了小胶质细胞，可能还存在其他机制，比如星型胶质细胞可能也参与了SNL引起的痛阈降低。最后，本研究只检测了IL-1β和TNF-α两种细胞因子，在病理性疼痛发生和发展过程中还有其他一些炎性因子也参与该过程，本研究没有全部检测。

總之，本研究发现SNL可导致大鼠MWT和TWL显著下降，脊髓背角TNF-α和IL-1β表达水平升高。鞘内注射MI可部分逆转SNL导致的痛阈下降，并且完全翻转SNL导致的TNF-α和IL-1β表达水平升高。该结果表明脊髓小胶质细胞参与调解SNL神经病理性疼痛，鞘内注射MI的镇痛效应可能与TNF-α、IL-1β密切相关。本研究可为临床研发新型镇痛药物提供理论与实验支持，靶向调控小胶质细胞可能成为治疗神经病理性疼痛的新策略。

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