抑制EphA4受体活性对少突胶质前体细胞发育影响的研究

辛伽伦++++++黄冬++++++夏冬东++++++刘之荣

[摘要] 目的 探讨抑制EphA4受体活性对少突胶质前体细胞（OPC）发育的影响。 方法 将分离纯化的OPC随机分为正常组、EphA4受体抑制剂处理组（EphA4-FC组）。EphA4-FC组加入250 nmol/L EphA4-FC，培养至第2天。免疫细胞化学染色法观察正常组OPC特异性标志物NG2与EphA4受体的共表达情况；通过细胞计数观察两组OPC数量变化情况；通过Western blot检测两组细胞蛋白样品中OPC特异性蛋白血小板源性生长因子α受体（PDGFαR）的表达变化情况。 结果 免疫细胞化学染色显示，正常体外培养OPC高表达EphA4受体；与正常组比较，EphA4-FC组的NG2+阳性细胞数量明显增多（P < 0.05）。Western blot显示，与正常组比较，EphA4-FC组细胞蛋白中PDGFαR的表达显著增高（P < 0.05）。 结论 培养的OPC上高表达EphA4受体，通过抑制EphA4受体可以促进OPC的增殖。

[关键词] EphA4受体；少突胶质前体细胞；慢性脑缺血；脑白质损伤

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（b）-0013-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of inhibit EphA4 receptor on oligodendrocyte progenitor cell （OPC）. Methods The purified OPC was randomly divided into normal group and EphA4-FC group （250 nmol/L， 2 d）. Immunofluorescence staining was used to observe the co-expression of NG2 （a marker for OPC） and EphA4 receptor. Cell counting was used to observe the change of OPC. Western blot was used to examine the expression of platelet-derived growth factor α receptor （PDGFαR， a marker for OPC） in two groups. Results Immunofluorescence staining showed that the high expression of EphA4 receptor on OPCs in vitro， and compared with normal group， more NG2+ cells were observed in the EphA4-FC group （P < 0.05）. Western blot showed that PDGFαR expression was significantly increased， compared with normal group （P < 0.05）. Conclusion EphA4 receptor is express highly on OPC in vitro， and inhibition of EphA4 receptor can promote OPC proliferation.

[Key words] EphA4 receptor； Oligodendrocyte progenitor cell； Chronic cerebral ischemia； White matter lesion

隨着人口老龄化进程发展，超过一半的老年人有不同程度的脑白质损伤（WML）[1]，慢性脑灌注不足是导致WML的主要原因[2-3]。脑白质的组成成分少突胶质细胞（OLs）、轴突和髓鞘对缺血高度易损，OLs的死亡丢失、轴突的变性坏死及髓鞘的脱失是WML的主要病理改变[4]。OLs来源于脑白质原位的OPC以及室管膜下区的多潜能神经干细胞[5-6]，脑白质脱髓鞘损伤后，损伤原位的OPC可通过增殖分化补充死亡丢失的OLs[7]。研究表明，Eph-Ephrin信号通路可影响OLs系的发育，如脊髓损伤后OPC和OLs上均有Eph受体表达[8]；OPC与轴突间可通过Eph-Ephrin相互作用进行迁移[9]；阻滞EphA4可促进小鼠脊髓损伤后轴突再生[10]；阻滞EphA4信号通路，可改善阿尔兹海默病小鼠模型中海马的突触功能障碍[11]。本课题组前期研究发现WML过程中存在OLs系的减少，同时伴随EphA4表达变化，两者呈负相关[12]。为此，设计本实验探讨抑制EphA4受体是否对OPC发育有影响作用。

1 材料与方法

1.1 材料

SD仔鼠[新生3 d，SPF级，40只，由第四军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（军）2012-0007；遵循第四军医大学有关实验动物保护和使用的指南，并经第四军医大学实验动物伦理委员会批准进行]。EphA4受体抑制剂EphA4-FC（R&D Systems），小鼠源性抗NG2抗体（Abcam），兔源性抗EphA4抗体（Abcam），兔源性抗PDGFαR抗体（Abcam），小鼠源性抗GAPDH抗体（康为世纪）。

1.2 方法

1.2.1 OPC细胞培养 采用本课题组前期研究的改良法培养OPC[13]，将其接种至事先包被过的含玻片的24孔培养板或培养皿中。

1.2.2 免疫细胞化学双标记染色 取出放置于24孔板内的细胞爬片，4%PFA固定20 min；PBS冲洗5 min×3次；一抗孵育（NG2=1∶500；EphA4=1∶250），4℃冰箱内孵育过夜；次日，PBS冲洗5 min×3次；二抗孵育（Rb-biotin=1∶250；Ms-cy3=1∶250），室温下避光孵育1 h；PBS冲洗5 min×3次；三抗孵育（avidin-cy2=1∶250），室温下避光孵育1 h；PBS冲洗5 min×3次，甘油封片、采图。

1.2.3 免疫細胞化学染色后细胞计数 将放置有细胞爬片的24孔板随机分成两组：正常组、EphA4-FC组。抑制剂处理组加入250 nmol/L EphA4-FC，培养至第2天后处理。染色方法同前，做3次以上进行数据分析，每次实验每组细胞至少选取3张细胞爬片，每张爬片不少于20个视野，用来观察并计数统计NG2/Hoechst+细胞，计数按双盲原则进行。

1.2.4 Western blot 将培养有OPC的培养皿随机分为两组：正常组、EphA4-FC组。抑制剂处理组加入250 nmol/L EphA4-FC，培养至第2天后处理。用细胞膜蛋白提取试剂盒（碧云天生物技术）提取各组细胞膜蛋白；测定蛋白浓度后制备蛋白样品；然后依次进行制胶，上样，电泳，转膜，封闭；孵育一抗（PDGFαR=1∶500，GAPDH=1∶3000），4℃过夜；孵育二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG=1∶10 000，HRP标记的山羊抗小鼠IgG=1∶10 000，康为世纪）室温1 h；洗膜后放入化学发光仪中显影、采图。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养OPC上EphA4受体表达情况

免疫细胞化学双标记染色法观察培养OPC中EphA4受体的表达结果，见图1。在正常培养的OPC细胞中，可见NG2+（红色）细胞与EphA4+（绿色）细胞共存。Merge结果显示，NG2+标记OPC细胞上大量表达EphA4受体，共标完全。

2.2 抑制EphA4受体活性对OPC增殖的影响

免疫细胞化学染色后通过细胞计数观察EphA4-FC对OPC增殖的影响结果，见图2。与正常组比较，EphA4-FC组的NG2+/Hoechst+双标阳性细胞数量明显增多（P < 0.05）。

2.3 抑制EphA4受体活性对OPC标记蛋白PDGFαR表达的影响

Western blot结果见图3。与正常组比较，EphA4-FC组的PDGFαR蛋白表达量明显升高（P < 0.05）。

3 讨论

研究表明，防治WML的关键是补充死亡丢失的OLs[14]。OLs主要来源于SVZ区的Type-B细胞，其分化产生OPC，OPC继续增殖后迁移至各白质区域，然后分化为成熟的OLs[15]。有研究发现，Eph受体家族成员EphA4在脊髓损伤修复中扮演了重要角色，可影响脊髓白质损伤修复及轴突再生过程[16]。本课题组在前期实验中发现，WML存在OPC及EphA4受体表达变化[12]。为此本研究通过EphA4-FC抑制OPC上EphA4受体活性，观察EphA4受体活性改变对OPC发育的影响。通过上述研究结果可以看出，正常培养的OPC细胞上有大量EphA4受体表达。对培养的OPC给予EphA4抑制剂处理后发现，与正常组相比，EphA4-FC组OPC细胞数量明显增多；同时，OPC特异性标志蛋白PDGFαR表达量的增多也反映了OPC细胞数量增多。由此表明，抑制OPC上的EphA4受体活性可以促进其增殖。虽然本实验发现EphA4受体对OPC发育有影响，但其作用机制尚不明确，通过查阅文献发现，Eph受体下游信号通路有ERK/MAPK、Rho-GTP等[17-18]。有研究表明，ERK/MAPK是调控细胞增殖分化的重要信号通路[19]；而RhoA信号通路是神经细胞轴突再生、导向，细胞骨架重塑等的关键环节[20]。Eph-Ephrin信号通路的激活可抑制ERK/MAPK，但激活RhoA[21]。由此可作出推测，OPC上存在的EphA4受体可通过Eph-Ephrin信号通路激活下游的RhoA并抑制ERK，最终发挥影响OPC发育的作用，这一过程还有待进一步探讨阐释。现有研究阶段表明，抑制EphA4受体活性可促进OPC的增殖，从而补充死亡丢失的OLs，达到防治WML的目的，这为WML的防治提供了新的理论依据。

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