Ki—67、Bcl—2、Bax和Caspase—3在脑胶质瘤组织中的表达及临床意义

于泽奇++++++程世翔++++++涂悦++++++王婧怡++++++苟莞苓++++++张赛

[摘要] 目的 探讨脑胶质瘤患者瘤组织中Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达水平及临床意义。方法 选取2014年10月～2016年10月武警后勤学院附属医院手术切除的65例脑胶质瘤组织切片。根据神经系统肿瘤分类将其分为低级别胶质瘤组34例和高级别胶质瘤组31例，另取18例正常脑组织切片标本作为对照组，比较3组标本组织中Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3表达水平，并分析其与胶质瘤恶性程度的相关性。 结果 随着胶质瘤病理级别的升高，Ki-67表达水平逐渐增强，在正常脑组织、低、高级别胶质瘤组中的表达阳性率分别为0、20.6%、77.4%，差异有统计学意义（P < 0.05），二者呈正相关性（Spearman相关系数为0.645，P < 0.05）。Bcl-2表达水平随着胶质瘤级别的升高而逐渐升高（6.2%、73.5%、100.0%），差異有统计学意义（P < 0.05），二者呈正相关性（Spearman相关系数为0.711，P < 0.05）。Bax表达水平随着脑胶质瘤级别的升高而逐渐降低（100.0%、82.4%、16.1%），差异有统计学意义（P < 0.05），二者呈负相关性（Spearman相关系数为-0.706，P < 0.05）。Caspase-3表达水平在低级别胶质瘤组最高（0、100.0%、80.6%），随病理级别的升高而逐渐降低（P < 0.05），二者呈负相关性（Spearman相关系数为-0.334，P < 0.05）。 结论 Ki-67与Bcl-2表达水平的上调，Bax与Caspase-3表达水平的下调，提示胶质瘤病理级别越高。同时，根据Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达水平可对胶质瘤恶性程度进行判断，在一定程度上对患者预后评估具有重要指导意义。

[关键词] 胶质瘤；Ki-67；Bcl-2；Bax；Caspase-3

[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（b）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the expression levels of Ki-67， Bcl-2， Bax and Caspase-3 in patients with brain glioma and its clinical significance. Methods 65 cases with brain glioma in Affiliated Hospital of Logistics College of PAP from October 2014 to October 2016 were selected and divided into low grade glioma group （34 cases） and high grade glioma group （31 cases） according to the classification of tumors of the nervous system. Another 18 cases with normal brain tissue specimens were selected as the control group. The expression levels of Ki-67， Bcl-2， Bax and Caspase-3 were detected and compared. Besides， their correlations with the malignant degree of glioma were analyzed. Results As the pathological grade of glioma increasing， the expression level of Ki-67 increased. The positive rates in normal brain tissue， low and high grade glioma group were 0， 20.6% and 77.4%， respectively， with statistically significant difference （P < 0.05）， and had a positive correlation with pathological grade （Spearman correlation coefficient was 0.645， P < 0.05）. The expression level of Bcl-2 increased with the increase of glioma grade （6.2%， 73.5%， 100%）， which showed a positive correlation with pathological grade （Spearman correlation coefficient was 0.711， P < 0.05）. The expression level of Bax decreased with the increase of glioma grade （100.0%， 82.4%， 16.1%）， which showed a negative correlation with pathological grade （Spearman correlation coefficient was -0.706， P < 0.05）.The expression level of Caspase-3 in low grade glioma group was the highest among groups， which decreased with the increase of pathological grade and showed a negative correlation with pathological grade （Spearman correlation coefficient was -0.334， P < 0.05）. Conclusion It shows the higher pathological grade of glioma is caused by the rising of the Ki-67 and Bcl-2 expression levels， as well as the decreasing of Bax and Caspase-3 expression levels. Meanwhile， it is very important in certain degree for the patients prognostic evaluation according to the judge the degree of glioma based on the Ki-67， Bcl-2， Bax and Caspase-3 expression levels.

[Key words] Glioma； Ki-67； Bcl-2； Bax； Caspase-3

胶质瘤是人类神经系统中最常见的一种原发恶性肿瘤[1]。胶质瘤患者死亡率高，其原因与胶质瘤侵入性生长方式有关[2]。Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤生长缓慢，病程长，但手术治疗后复发率高。Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤生长迅速，病程短，且瘤体占位性效应可引发患者呕吐、视神经萎缩和癫痫等[3]。胶质瘤起病机制复杂，常与多种因素相关联[4]。随着医疗技术的不断发展，对胶质瘤的检查、确诊更为快捷。为了解Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达水平与胶质瘤间的相互联系，本文通过免疫组化法对其进行检测，来探讨是否可以根据Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達水平来指示患者的预后情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年10月～2016年10月武警后勤学院附属医院（以下简称“我院”）脑胶质瘤患者经外科手术治疗后切除的胶质瘤标本65例。将65例患者根据WHO 2007 年中枢神经系统肿瘤分类标准[5]分为2类：①低级别胶质瘤，肿瘤分级Ⅰ～Ⅱ级，其中星形细胞瘤15例，少枝胶质细胞瘤19例。②高级别胶质瘤，肿瘤分级Ⅲ～Ⅳ级，其中9例间变性星形细胞瘤，12例胶质母细胞瘤，10例髓母细胞瘤。除此之外，取18例因外伤或者脑出血而进行颅内减压的正常脑组织标本作为对照。本次研究已获我院伦理委员会的审批与认可，所有标本均取自有完整病历资料并经我院病理科证实的患者，且患者手术前未进行放化疗。

1.2 试剂与仪器

Ki-67兔抗人单克隆抗体、Bcl-2兔抗人单克隆抗体、Bax兔抗人单克隆抗体、Caspase-3兔抗人单克隆抗体（美国Abcam），免疫组化染色试剂盒、DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），石蜡切片机（德国Leica），倒置相差显微镜（日本Nikon）。

1.3 免疫组织化学染色

所有标本经4%中性甲醛固定，脱水后石蜡包埋，将石蜡组织标本行5 μm厚连续切片，经脱蜡，EDTA抗原修复，3%双氧水消除内源性过氧化物酶，血清封闭1 h后，分别滴加Ki-67、Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗（稀释浓度分别1∶100、1∶250、1∶100、1∶100）4℃孵育过夜，PBS清洗后滴加辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1 h。DAB显色，冲洗，苏木精复染细胞核，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用PBS液代替一抗做阴性对照。

1.4 阳性结果判定标准

Ki-67阳性判定：细胞核中出现棕黄色着色；Bcl-2细胞阳性判定：细胞核和细胞质中出现黄色颗粒；Bax蛋白阳性判定：细胞质中出现棕黄色显色；Caspase-3阳性判定：细胞质中发现棕黄色颗粒。标本采用光学显微镜进行观察，由两名资深病理科医师采用双盲法对结果进行判定。每个脑组织切片随机选择5个不同的高倍视野，取200个肿瘤细胞，计算阳性细胞数及检测阳性细胞染色程度。表达程度分为4级：①细胞呈现无显色或出现阳性细胞数0%，表达程度为（-）；②细胞呈现浅显色或出现阳性细胞数<50%，表达程度为（+）；③细胞呈现深显色或出现阳性细胞数≥50%，表达程度为（++）；④细胞呈现明显或出现阳性细胞数≥85%，表达程度为（+++）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行分析，组间Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3阳性率比较采用卡方检验，相关性分析采用Spearman法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ki-67在不同病理级别脑胶质瘤组织及正常脑组织中的表达

Ki-67在正常脑组织中无表达，阳性率为0%；在低级别胶质瘤中表达水平升高，阳性率为20.6%；在高级别胶质瘤中Ki-67表达水平最高，阳性率为77.4%，差异有统计学意义（P < 0.05）。Ki-67表达水平与胶质瘤级别呈正相关性（Spearman相关系数为0.645，P < 0.05）。见表1。

2.2 Bcl-2在不同病理级别脑胶质瘤组织及正常脑组织中的表达

Bcl-2在正常脑组织中表达阳性率为6.2%，在低级别胶质瘤中阳性率为73.5%；在高级别胶质瘤中的阳性率为100%，差异有统计学意义（P < 0.05）。Bcl-2表达水平与胶质瘤恶性程度两者存在正相关性（Spearman相关系数为0.711，P < 0.05）。见表2。

2.3 Bax在不同病理级别脑胶质瘤组织及正常脑组织中的表达

Bax在正常脑组织中广泛表达，阳性率为100%；在低级别胶质瘤中阳性率为82.4%；在高级别胶质瘤中表达水平最低，阳性率为16.1%，差异有统计学意义（P < 0.05）。Bax表达水平与胶质瘤级别呈负相关性（Spearman相关系数为-0.706，P < 0.05）。见表3。

2.4 Caspase-3在不同病理级别脑胶质瘤组织及正常脑组织中的表达

Caspase-3在正常脑组织中阳性率为0%，在低级别胶质瘤中阳性率为100.0%，在高级别胶质瘤中阳性率为80.6%，差异有统计学意义（P < 0.05）。随恶性程度的增高，Caspase-3表达水平有所降低（Spearman相关系数为-0.334，P < 0.05）。见表4。

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，常呈浸润性生长，与周围正常脑组织无明显分界，术后易复发，患者生存率低，危害性大[6]。研究表明，胶质瘤不仅存在细胞增殖与分化障碍，同时还存在凋亡受阻，细胞增殖与凋亡的不平衡状态是导致胶质瘤恶性生长的基础[7]。鉴于此，控制其生长速度成为治疗胶质瘤的关键。

Ki-67是存在于增殖细胞核内的一种非组蛋白性核内蛋白，在1983年由Scholzen等[8]研究Hodgkin淋巴瘤L428细胞系时发现。Ki-67定位于人类第10号染色体长臂上，由分子量为345 kD和395 kD的两条多肽链组成，位于近核仁区[9]。它能识别G1晚期、S期和G2/M期细胞核的抗原，而处于静息状态的G0期和G1早期细胞缺乏此抗原。因此，临床上常以此作为细胞增殖的标记蛋白[10]。同时，多数研究表明Ki-67能够可靠而迅速地反映肿瘤增殖率，与多种肿瘤的发生、进展、转移及预后相关[11]。本研究对65例胶质瘤标本及18例正常脑组织标本进行免疫组化，发现Ki-67表达水平随胶质瘤恶性程度的升高而表达明顯，与胶质瘤病理级别呈正相关性（P < 0.05）。

近年来，随着对胶质瘤研究的不断深入，人们发现Bcl-2和Bax是与细胞凋亡密切相关的蛋白，主要位于细胞质内[12]。Bcl-2为凋亡抑制因子[13]，是从淋巴瘤中分离出来的原癌基因，Bcl-2基因定位于人类染色体18q21上；Bax为凋亡诱导因子[14]，定位于人类染色体19q13上，其蛋白主要存在细胞质中。当受到凋亡信号刺激时，Bax便从细胞质转移至线粒体，再与线粒体膜上的Bcl-2相互作用从而发挥促凋亡作用。当Bcl-2/Bax比值低时，形成Bax-Bax同源二聚体，促进细胞凋亡[15]；当二者比值高时，可形成更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体，抑制细胞凋亡[16]，这种比率的变化是由于Bcl-2与Bax蛋白间竞争性二聚化作用的结果。在本研究中，Bcl-2与Bax均有明显表达，但随胶质瘤病理级别的升高，Bcl-2表达逐渐升高（P < 0.05），Bax表达逐渐降低（P < 0.05），Bcl-2/Bax比值相对升高，其抗凋亡活性增强。即胶质瘤病理分级程度越高，癌细胞抗凋亡能力越强。由此可见，Bcl-2/Bax比值的测定对于临床上胶质瘤恶性程度的判定具有重要的参考价值。此外，Bcl-2还可调控线粒体渗透性转换孔的开启，抑制细胞色素色C，从而抑制Caspase-3的活化，同时Caspase-3的合成也受Bcl-2的调节抑制[17]。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，它通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中，在凋亡信号的刺激作用下被激活，可对多种蛋白底物进行降解，从而在细胞凋亡过程中起重要作用[18]。研究发现，Caspase-3可通过阻滞细胞周期，裂解细胞结构物质，破坏平衡状态及修复机制等促进细胞凋亡的发生[19]。此外，Caspase-3还可降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，使Caspase家族成员激活并被水解后发生级联反应，最后在核小体连接处切割DNA链接片段，促进细胞凋亡的发生[20]。在本研究中，Caspase-3蛋白表达阳性率在高级别胶质瘤组明显低于低级别胶质瘤组，差异有统计学意义（P < 0.05），提示Caspase-3表达下调与胶质瘤的恶性进展密切相关。

综上所述，Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达与胶质瘤的恶性进展密切相关，Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平上调，Bax、Caspase-3蛋白表达水平下调，提示胶质瘤病理级别越高。同时，Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3有可能成为胶质瘤治疗的有效靶点，为临床上治疗胶质瘤提供新的思路。然而胶质瘤发生、发展的根本原因可能还涉及多种凋亡基因，原癌基因及抑癌基因等，因此对胶质瘤的调控机制还有待进一步研究。

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