谷瘟病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及抑菌活性

牛倩云，刘丽青，孙 硕，仪慧兰

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

谷瘟病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及抑菌活性

牛倩云，刘丽青，孙 硕，仪慧兰

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

采用平板稀释法从谷子根际土壤中分离到放线菌93株，以谷瘟病菌为指示菌，利用平板对峙法筛选拮抗菌株，得到1株对谷瘟病菌有良好拮抗效果的菌株A26，抑菌率达63.9%；结合形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为黄三素链霉菌（Streptomyces flavotricini）。初步研究证实，A26无菌发酵液对谷瘟病菌有较强的抑制作用，随发酵液用量加大抑菌率提高，当无菌发酵液体积分数为50%时，对谷瘟病菌的抑制率可达87.4%。该拮抗菌的分离为谷瘟病的生物防治及其防治机制的研究提供了基础。

谷瘟病；谷子；放线菌；拮抗作用

谷子是我国重要的粮食作物之一，具有抗旱、耐贫瘠、水分利用率高、营养丰富等特点，在农业生产中占据重要地位。山西省是谷子的主产区，播种面积在全国位居第2，然而，谷子病害的不断发生严重影响了谷子的产量和品质[1]。目前，最常见且危害严重的谷子病害主要有：白发病、黑穗病、锈病、谷瘟病和纹枯病[2]。其中，谷瘟病的病原菌为粟梨孢菌（Pyricularia setariae Nishik），该病菌不仅可侵染叶片，引起谷子苗叶枯死，还可侵染叶鞘、茎节、穗部，形成茎节瘟和穗颈瘟，使谷穗萎缩，从而造成谷子减产[3]。

现阶段对谷瘟病的主要防治措施有：选育种植抗病性强的谷子品种；加强田间管理，控制好种植密度，实行作物间的轮作；使用有机磷杀菌剂如克瘟散、三环唑、春雷霉素等进行药剂防治。但由于抗病性强的谷子品种单一，而化学药剂的长期使用会导致病原菌产生抗药性，并引起农田和粮食的农药残留，严重威胁食品安全和生态环境[4]。因此，迫切需要寻求新型、有效、无公害的防治措施来控制植物病害。而生物防治被认为是一种高效安全的方法，获得拮抗菌是生物防治的基础[5]。目前，国内利用生防菌防治谷子真菌性病害的研究主要是针对谷子纹枯病，董立[6]等、王燕[7]分别从谷子根际土壤中筛选到对纹枯病有良好拮抗作用的生防菌，对其进行盆栽试验和田间防治效果研究，结果发现，拮抗菌对谷子纹枯病有显著的防治效果，而对谷瘟病生物防治的研究鲜有报道。

本研究从谷子根际土壤中分离、筛选得到对谷瘟病菌有良好拮抗作用的放线菌，并结合形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对其进行鉴定，以期为谷瘟病生防菌剂的研究和开发提供优良的菌种资源。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与培养基

土壤样品：于山西省农业科学院谷子研究所谷子试验田采集不发病植株根际土壤，低温保存带回实验室，4℃保存备用。

供试病原菌：谷瘟病病原菌——粟梨孢菌，由山西省农业科学院谷子研究所郭二虎研究员惠赠。

主要试剂：PCR试剂购于北京全式金生物技术有限公司；溶菌酶、蛋白酶K等试剂购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要培养基：培养特征、生理生化特征试验所用的培养基均采用放线菌培养、分离鉴定常用培养基[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 土壤放线菌的分离纯化 取土样10 g，用无菌水稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的土壤悬液，吸取不同梯度土壤悬液各200μL于高氏一号固体平板上，涂布均匀，28℃倒置培养5～7 d。根据平板上菌落的形态、颜色、大小等特征，挑取不同单菌落进行划线纯化培养，将纯化菌株4℃保存备用。

1.2.2 拮抗菌的筛选 采用平板对峙法，从分离得到的放线菌中筛选拮抗菌株。将谷瘟病菌和放线菌分别培养5～7 d后，制成直径8 mm的菌饼。取谷瘟病菌菌饼倒贴于PDA平板中央，在距离中央2.5 cm处对称接种放线菌菌饼，以不接放线菌的平板作为对照，每个处理重复3次，28℃培养7 d后观察记录结果，并计算抑菌率，选择抑菌率高的菌株作为拮抗菌株。

抑菌率＝（对照组病原菌菌落半径－处理组病原菌菌落半径）/对照组病原菌菌落半径×100%。

1.2.3 拮抗菌的鉴定

1.2.3.1 形态学特征 将筛选得到的拮抗菌株（A26）接种于高氏一号培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、酵母膏麦芽汁琼脂培养基、无机盐淀粉琼脂培养基、蛋白胨酵母铁琼脂培养基，28℃培养5～7 d，观察记录菌落形态、生长状况、可溶性色素产生情况、基内菌丝和气生菌丝颜色。利用插片法[8]，在光学显微镜下观察菌丝的形态特征。

1.2.3.2 生理生化特征 葡萄糖利用、蔗糖利用、尿素利用、H2S产生、黑色素产生、明胶液化、淀粉水解、纤维素利用等生理生化试验均参照文献[9]的方法进行。

1.2.3.3 16S rDNA序列分析 采用改良的CTAB法提取DNA，选取通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′；1492R：5′-ACGGYTACCTTGTTAC GACTT-3′）对菌株16S rDNA进行扩增。PCR扩增体系为20μL，包括：10×buffer 2μL，dNTP 1.6μL，引物各0.8μL，DNA模板0.4μL，Taq酶0.2μL，双蒸水14.2μL。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京华大基因科技有限公司测序。将测得的序列在Ezbiocloud数据库中进行同源比对，并利用MEGA 5.1软件通过邻接法构建系统发育树，通过Bootstrap（重复抽样1 000次）分析树的稳定性，初步确定拮抗菌可能的属和种。

1.2.4 拮抗菌无菌发酵液抑菌活性的测定

1.2.4.1 发酵不同天数的无菌发酵液抑菌活性的测定 将菌株A26菌饼接种于100 mL高氏一号液体培养基中，28℃，150 r/min振荡培养，在培养3，5，7，9，11 d后，分别取发酵液于4℃，4 000 r/min离心5 min，收集上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得无菌发酵液，4℃保存备用。将无菌发酵液以体积分数20%的比例与PDA培养基混匀倒平板，以加等量无菌水的平板为对照。挑取谷瘟病菌菌饼倒贴于平板中央，于28℃培养。待对照平板长满菌丝时，测量各平板中谷瘟病菌菌落半径，并计算抑菌率。每个处理重复3次。

1.2.4.2 不同体积分数无菌发酵液抑菌活性的测定

将无菌发酵液分别以体积分数5%，10%，20%，30%，50%的比例与PDA培养基混匀倒平板，在混合平板中央放置谷瘟病菌菌饼，每个处理重复3次，以相同体积分数的无菌水处理作为对照，于28℃培养。待对照组菌丝长满平板时测量各组菌落半径，并计算抑菌率。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的分离与筛选

从土壤样品中共分离到放线菌93株。通过平板对峙试验，最终获得1株对谷瘟病菌拮抗效果较好的菌株（图1），抑菌率达63.9%，编号为A26。

2.2 拮抗菌A26的鉴定

菌株A26在高氏一号培养基上生长良好，菌落边缘整齐，为同心圆环，菌落中央菌丝粉状，气生菌丝呈紫灰色，基内菌丝无色，无可溶性色素产生（图2-A）。在光学显微镜下观察，菌株A26菌丝无横隔，不断裂，呈分枝状，孢子丝长，孢子直链排列，表面光滑，呈椭圆形至圆柱形（图2-B）。根据这些特征，将菌株A26鉴定为链霉菌[9]。

菌株A26在马铃薯葡萄糖琼脂培养基、酵母膏麦芽汁琼脂培养基、无机盐淀粉琼脂培养基、蛋白胨酵母铁琼脂培养基上生长良好，气生菌丝分别为紫灰色、浅红色、白色、灰白色；基内菌丝除马铃薯葡萄糖琼脂培养基为浅黄色外，其他均为无色；在蛋白胨酵母铁琼脂培养基中产生了黑色可溶性色素，其他培养基中不产生色素（表1）。

表1 菌株A26的培养特征

生理生化特征分析结果显示（表2），菌株A26能利用葡萄糖、尿素，不能利用蔗糖，能产生黑色素和H2S，能使明胶液化、淀粉水解，不能分解纤维素。

表2 菌株A26的生理生化特征

将A26菌株16S rDNA序列在Ezbiocloud数据库中进行同源性比对，结果显示，其与黄三素链霉菌（S.flavotricini）相似度达到100%；构建系统进化树（图3），结果发现，菌株A26与黄三素链霉菌（S. flavotricini）聚为一支，表明其与黄三素链霉菌亲缘关系较近。因此，结合形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析结果，初步确定该株放线菌为黄三素链霉菌。

2.3 拮抗菌A26无菌发酵液的抑菌活性

菌株A26的无菌发酵液对谷瘟病菌有显著的抑制作用（图4），且发酵时间对其抑菌作用的强弱有一定影响。发酵7 d的无菌滤液抑制作用最强，抑菌率达52.3%，继续发酵其抑菌活性呈下降趋势。故后续的试验取发酵7 d的发酵液进行。

检测不同体积分数无菌发酵液的抑菌活性发现，无菌发酵液的体积分数越大，对谷瘟病菌的抑制效果越明显，当体积分数为50%时，抑菌率达87.4%（图5）。

3 讨论

本研究利用平板对峙法，从谷子根际土壤分离的放线菌中筛选出1株对谷瘟病菌有显著拮抗作用的菌株A26，根据其形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，初步确定该株放线菌为黄三素链霉菌。放线菌是与人类关系最为密切的微生物类群之一[10]，种类繁多，分布广泛，是盛产抗生素的一类菌，是微生物农药的重要来源[11]。其中，链霉菌属是最高等的放线菌，主要分布在土壤中，以产多种抗生素而著称[12]，是植物病原菌拮抗菌的主要菌属之一，在植物病害的生物防治方面具有良好的应用前景[13-15]。黄三素链霉菌作为链霉菌属的一员，关于其抑菌作用的报道及在生物防治中的应用逐渐增多。郑金土等[16]从土壤中分离出1株对杨梅溃疡病有拮抗作用的菌株，经鉴定为黄三素链霉菌；KHALIL等[17]从稻田获得的黄三素链霉菌对水稻稻瘟病菌有明显的拮抗作用；HEMANT等[18]分离到的黄三素链霉菌能抑制茄丝核菌，减少番茄根部的腐烂，抑菌率为40.14%；XUE等[19]从棉花根际土中分离出1株黄三素链霉菌，对棉花黄萎病菌的抑制率为65.8%，同时田间防治效果显著，防效达51.04%。本研究筛选的拮抗菌株A26也为黄三素链霉菌，对谷瘟病菌的抑制作用明显，表明菌株A26可作为谷瘟病害生物防治的良好资源。

有研究表明，拮抗菌对植物病害的防治机制主要有2种：分泌代谢拮抗物质和竞争空间位置及营养成分[20]。菌株A26的无菌发酵液对谷瘟病菌有良好的抑菌活性，说明菌株A26可能是通过分泌某种化学物质发挥抑菌作用的。检测发酵不同时间发酵液的抑菌效果发现，发酵7 d的无菌发酵液抑菌作用最强，抑制率达52.3%，继续发酵其抑菌率下降，可能是由于随着发酵时间的延长，培养基内营养成分逐渐减少[21]。另外，不同体积分数无菌发酵液抑菌活性的研究结果表明，抑菌效果随着发酵液体积分数的增加而增强，当体积分数为50%时，抑菌率达87.4%，进一步说明菌株A26对谷瘟病菌的拮抗作用与其所产生的抑菌活性物质的多少呈正相关。

现阶段，我国对谷瘟病的防治措施主要是选用抗病品种和药剂防治，对生物防治的研究报道相对较少，本研究首次报道了黄三素链霉菌对谷瘟病菌的拮抗作用，且筛选出的菌株A26拮抗作用稳定，其无菌发酵液具有显著的抑菌效果，为研究谷瘟病的生防菌剂奠定了基础。

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Screening and Identification of Antagonistic Actinomycetes against P yricularia setariae Nishik and Analysis of Its Antipathogenic Activity

NIUQianyun，LIULiqing，SUNShuo，YIHuilan

（College ofLife Science，ShanxiUniversity，Taiyuan 030006，China）

By using the dilution plate method,93 actinomycetes strains were separated from the rhizosphere offoxtailmillet.One of them named A26 strain showed the strongest antagonistic effect against Pyricularia setariae Nishik.Based on morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA phylogenetic analysis,A26 strain was identified as Streptomyces flavotricini.Furthermore,the cell-free fermentation filtrate of A26 had significant inhibition on growth of Pyricularia setariae Nishik. Inhibitory percentage increased with increasing the dose of fermentation filtrate of A26 and reached 87.4%when the volume of fermentation filtrateat reached 50%.Conclusively,our research provides a useful data for further studying on the the mechanism and biologicalcontroloffoxtailmilletblast.

foxtailmilletblast;foxtailmillet;actinomycete;antagonistic effect

S435.15

：A

：1002-2481（2017）09-1525-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.31

2017-04-07

国家自然科学基金面上项目（31371868）；国家现代农业产业体系建设专项（CARS-07-12.5-A10）

牛倩云（1993-），女，山西太原人，在读硕士，研究方向：植物逆境生物学。仪慧兰为通信作者。