熊果酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制

郑蕾

(郑州儿童医院，郑州450000)

熊果酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制

郑蕾

(郑州儿童医院，郑州450000)

目的 探讨熊果酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法 取对数生长期舌鳞癌细胞Tca-8113，随机分为观察组和对照组。观察组给予60 μmol/L熊果酸处理，对照组给予等体积DMSO溶液处理。处理48 h，采用MTT法检测两组细胞增殖活性，流式细胞术检测两组细胞凋亡指数，Western blotting法检测两组Caspase-3、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量。结果 处理48 h，观察组、对照组细胞增殖活性分别为0.56±0.04、0.98±0.06，细胞凋亡指数分别为0.48±0.05、0.15±0.02，两组比较P均<0.05。观察组、对照组Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.42±0.02、0.14±0.03，两组比较P<0.05；ERK1/2蛋白相对表达量分别为0.36±0.03、0.35±0.04，两组比较P>0.05；p-ERK1/2蛋白相对表达量分别为0.12±0.01、0.32±0.03，两组比较P<0.05。结论 熊果酸可抑制舌鳞癌细胞增殖，并促进其凋亡，其机制可能与促进Caspase-3表达、抑制ERK磷酸化有关。

舌鳞状细胞癌；熊果酸；细胞增殖；细胞凋亡

舌鳞状细胞癌(简称舌鳞癌)是头颈部常见的恶性肿瘤，近年来其发病率有升高趋势[1]。熊果酸是一种存在于多种植物中的五环三萜类化合物，可抑制膀胱癌、胃癌、肝癌等细胞增殖[2～4]。但目前鲜见熊果酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡影响的报道。2013年1月～2015年3月，我们进行了相关研究，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 舌鳞癌细胞Tca-8113，由本实验室保存。MTT、PI、Annexin-V、PVDF膜，购自美国Sigma公司。Caspase-3单克隆抗体、ERK1/2单克隆抗体、p-ERK1/2单克隆抗体、辣根过氧化物标记的二抗、流式细胞仪，购自杭州联科生物股份有限公司。

1.2 细胞培养及熊果酸干预 取对数生长期舌鳞癌细胞Tca-8113，胰蛋白酶消化，用细胞生长液重悬细胞并吹打成单细胞悬液，细胞悬液密度为5×104个/mL，然后接种于96孔板中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。随机将细胞分为观察组和对照组，每组设8个复孔。观察组给予60 μmol/L熊果酸处理，对照组给予等体积DMSO溶液处理。两组均处理48 h。

1.3 相关指标观察

1.3.1 细胞增殖活性 采用MTT法。各组处理48 h，每孔加入5 mg/mL的MTT，37 ℃孵育4 h，弃上清液，加入100 μL DMSO溶液，振荡混匀，酶标仪490 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值。以OD490值表示细胞增殖活性。

1.3.2 细胞凋亡指数 采用流式细胞术。取各组处理48 h细胞，胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心10 min，加入PBS，吹打成密度为1×106个/mL的细胞悬液。取细胞悬液1 mL，离心后弃上清，加入结合缓冲液500 μL，充分混匀，然后加入5 μL Annexin V和5 μL PI充分混匀，室温孵育10 min，上流式细胞仪检测。

1.3.3 Caspase-3、ERK1/2、p-ERK1/2表达 采用Western blotting法。取各组处理48 h细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心5 min，取蛋白上清液，加入上样缓冲液充分混匀，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性的蛋白样品50 μL进行SDS-PAGE，初始电压为80 V，30 min后调整电压为120 V，至电泳结束。然后将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜后分别加入一抗和二抗孵育，在暗室中显影。以目的蛋白电泳条带灰度值与内参GAPDH电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞增殖活性比较 观察组、对照组细胞增殖活性分别为0.56±0.04、0.98±0.06，两组比较P<0.05。

2.2 两组细胞凋亡指数比较 观察组、对照组细胞凋亡指数分别为0.48±0.05、0.15±0.02，两组比较P<0.05。

2.3 两组ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3蛋白表达比较 观察组、对照组Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.42±0.02、0.14±0.03，ERK1/2蛋白相对表达量分别为0.36±0.03、0.35±0.04，p-ERK1/2蛋白相对表达量分别为0.12±0.01、0.32±0.03。两组Caspase-3、p-ERK1/2蛋白相对表达量比较P均<0.05，ERK1/2蛋白相对表达量比较P>0.05。

3 讨论

正常情况下，机体内细胞增殖和凋亡是一个动态平衡过程，而在细胞癌变时，机体内细胞异常增殖和分化，逐渐转移和浸润形成肿瘤[5,6]。

熊果酸是一种提取于植物中的三萜类化合物，具有抗炎、抗氧化、调节血脂、提高免疫力、抗病毒等多种作用[7]。近年研究发现，熊果酸可抑制胃癌、肝癌等多种肿瘤细胞增殖[8，9]。本研究结果显示，观察组细胞增殖活性明显低于对照组，细胞凋亡指数明显高于对照组。表明熊果酸可抑制舌鳞癌细胞增殖，并促进其凋亡。

细胞凋亡是由多种基因控制的细胞自主、有序的死亡。Caspase蛋白家族在细胞凋亡过程中具有重要作用。正常情况下，Caspase蛋白家族以酶原的非活化形式分布在细胞中。当细胞发生凋亡时，Caspase蛋白家族成员之间可相互激活，发生一系列级联反应[10，11]，其中Caspase-3的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)在细胞信号传导过程中起媒介作用，可将细胞外的信号传递至细胞内，调控细胞增殖和凋亡等生物学行为。MAPK主要通过细胞外信号调节ERK、p38 MAPK、JNK、BMK1等途径发挥相应的生理学作用。其中，ERK途径是MAPK信号通路的主要组成部分[12，13]；ERK1/2是ERK途径的主要成员，可参与细胞增殖和凋亡。有研究表明，熊果酸可抑制胃癌细胞和胶质瘤细胞ERK1/2活化，激活Caspase-3，继而促进细胞凋亡[14]。本研究观察组Caspase-3蛋白相对表达量明显高于对照组，p-ERK1/2蛋白相对表达量明显低于对照组，但两组ERK1/2蛋白相对表达量比较无统计学差异，说明熊果酸能促进舌鳞癌细胞Caspase-3表达，抑制ERK1/2磷酸化，这可能是熊果酸抑制舌鳞癌细胞增殖并促进其凋亡的机制。

综上所述，熊果酸可抑制舌鳞癌细胞增殖，并促进其凋亡，其机制可能与促进Caspase-3表达、抑制ERK磷酸化有关。

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