循环游离DNA的定量检测及面临的问题

李铁军张孝卫

循环游离DNA的定量检测及面临的问题

李铁军★张孝卫

循环游离DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）与人类疾病之间存在着密切联系。近年来，cfDNA做为一种无创检测生物标志物，展现出临床应用前景。人们针对其含量较低的特点，进行了大量研究，开发出了各种较为可靠的定量检测方法。但目前cfDNA的定量检测仍然面临问题及争议，缺乏规范和标准化的流程。本文对cfDNA的来源组成、定量检测及存在的问题进行了归纳整理及分析，希望能对提高cfDNA的定量检测的可靠性提供有益的参考。

循环游离DNA；标准化；PCR

循环游离DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）是指循环血中游离于细胞之外的DNA。由于近年来DNA提取、检测、测序等分子生物学技术的飞速发展，使得cfDNA的研究取得了长足进步，与疾病之间的关系逐渐被揭示出来。cfDNA做为生物标志物，在疾病筛查、诊断、治疗监控、预后、疾病复发等方面表现出令人振奋的应用潜力。特别是对突变及甲基化循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的研究，在肿瘤的防控中开始显现重要作用［1］。

cfDNA检测的可靠性是其后续应用的基本保障，关系到其做为生物标志物的应用前景，然而目前cfDNA的检测仍然存在诸多问题，从采用血清还是血浆标本的争议，到标本采集流程、检测方法、结果判读、正常值等均缺乏统一标准，各实验室之间的结果没有可比性。对cfDNA检测的规范和标准化，是cfDNA走向实际应用的必然选择。cfDNA，其英文名称也并不统一，有cell-free DNA （cfDNA）、Circulating DNA、Circulating Cell Free DNA（CCFDNA）、Free circulating DNA（fcDNA）、cell-free circulating DNA等。目前cfDNA检测的常用方法有实时荧光定量PCR（qPCR）法、荧光染料法、bDNA技术等。下面本文对cfDNA的来源组成、定量检测（标本选择、DNA提取和多种检测方法）及存在的问题进行了归纳探讨，希望能对提高cfDNA的定量检测的可靠性提供有益帮助。

1 cfDNA的来源、组成大小及代谢

一般认为，细胞凋亡是血清或血浆cfDNA的主要来源。其他来源有坏死肿瘤细胞的溶解、白细胞的分解、新合成核酸的自主释放、细菌病毒等病原体的分解等［1］。cfDNA在血液与蛋白质或膜结合颗粒形成天然复合物，能抵抗核酸酶的降解。

cfDNA凝胶电泳分析显示，主要条带在180 bp左右，其次分布在360 bp附近。与缠绕在单核小体和双核小体的DNA长度相符。提示我们cfDNA源于细胞凋亡［2-4］，细胞坏死释放出的DNA由于被不完全和非特异性消化，其片段大小约10 000 bp［5］。小鼠肝细胞凋亡时，血浆cfDNA增加的现象也支持了凋亡为cfDNA的来源这一说法［6］。

近年来，不同实验室利用DNA测序技术，对血浆cfDNA大小进行了更精确的分析，分辨率达1个碱基。测序研究显示［7-8］：cfDNA大小主要分布在166 bp。测序分析与电泳结果基本保持了一致。cfDNA的大小是我们利用PCR技术检测时需要考虑的因素。

研究表明，癌症患者与健康个体相比有较高的cfDNA水平。这些升高的cfDNA主要来自癌细胞［9-11］。正常健康人群的cfDNA水平较低，但在某些病理情况下会显著升高。比如恶性肿瘤、手术和创伤、中风、心衰、自身免疫性疾病、胰腺炎、重症监护相关状况、运动员大量训练后等［12］。

cfDNA不仅来自于人类细胞，还含有人类微生物组的DNA。有研究证实细菌16S rRNA基因存在于患者与健康对照的人群的血液循环中［13-14］。虽然细菌或病毒DNA属于外源性DNA，但在研究cfDNA的总浓度、组成、与疾病的关系等方面，必须考虑到这一因素。

值得注意的是，cfDNA的浓度及组成始终是一个动态过程。cfDNA是蛋白质结合DNA，其半衰期较短，文献报道的半衰期从几分钟到2 h不等［1，15，19］。在大鼠模型中，cfDNA的清除主要在肝脏和肾脏，肝脏是主要的摄取部位［16］。肝脏摄取单链DNA比双链DNA快。肾脏清除并不是cfDNA的主要清除机制［17］，慢性肾病、透析患者的cfDNA水平并没变化。但循环突变KRAS DNA可通过肾脏排出，并在尿液中检测出［18］。

2 cfDNA的定量检测

cfDNA的检测大致可分为cfDNA总浓度的检测和其中一部分DNA的检测，比如ctDNA的检测。特别是对突变或甲基化ctDNA的检测，将极大地提高游离DNA作为疾病生物标志物的特异性和敏感性，增加游离DNA检测的应用前景。

2.1 标本选择

血浆或血清均可做为cfDNA提取及检测的样本，但两者的cfDNA浓度存在差异，选择哪一个并没有统一标准。一般认为，由于凝血过程中白细胞溶解，释放DNA入血，因此血清cfDNA总浓度高于血浆。从避免白细胞基因组DNA混入待测标本的角度考虑，采用血浆标本似乎是更加合理的选择。选择血浆为标本的研究也相对较多。

血液存放时间会对cfDNA浓度产生影响。有研究显示，血浆cfDNA在8 h内没有变化，但血清cfDNA浓度在4 h时增加，并随时间延长持续增加［4］。因此血浆分离前血液在4°C的最大存放时间是8 h，而血清应立刻分离以避免基因组DNA的污染。还有研究认为［20］，肿瘤患者血浆cfDNA的浓度经历了一个由高到低，再由低到高的过程。2 h时血浆中cfDNA的浓度较高，放置6 h时游离DNA的浓度明显下降，30 h时又有所增加。

EDTA抗凝全血在加入细胞膜稳定剂的情况下，室温放置0、3、6 d后离心取血浆，cfDNA浓度未见明显变化。在未加细胞稳定剂时，3、6 d的cfDNA水平显著增高。但加入的外源标准DNA对照（standard external DNA control，EDC）在加与不加细胞膜稳定剂时未见明显变化，说明cfDNA浓度变化与提取方法无关，而与细胞稳定剂相关。细胞膜稳定剂的加入可以有效抑制血细胞溶解，释放DNA入血［21］。

可以看出，血液存放的时间长短确实对cfDNA水平产生影响。因此，在条件允许的情况下，采血后最好立刻分离血浆或血清，避免外源DNA的混入及浓度波动，最大程度地反映cfDNA的原貌。

另外，采血部位对cfDNA浓度也可能造成影响。采用直接qPCR法测定血浆cfDNA的浓度时发现，肘前静脉的血浆cfDNA的浓度（17.6 ng/mL）显著高于指尖毛细血管cfDNA浓度（8.7 ng/mL）［22］。可见，采血部位也是cfDNA检测标准化需要考虑的因素之一。

2.2 cfDNA提取

目前，血浆或血清cfDNA的提取基本全部采用商业化试剂盒。由于cfDNA浓度极低，提取困难，不同方法提取效率差异明显。比较常用的试剂盒为微柱吸附式的QIAamp®DNA blood mini kit （DBM），其次是磁珠式DNA纯化试剂盒。但这些试剂盒主要用于从血细胞提取高度完整性的基因组DNA，而不是用于高度碎片化的cfDNA，因此可能导致提取效率较低。Devonshire AS等［23］将3种cfDNA专用提取试剂盒与DBM试剂盒进行了详细研究比较，认为QIAamp®circulating nucleic acid （CNA）kit试剂盒在提取率和提取小片段方面均优于DBM试剂盒。Repiská G等［24］的研究也得出了相似结论，认为CNA或DSP Virus Kit（DSP）可以取代普遍使用的DBM试剂盒。还有研究表明，磁珠法提取效率高于DBM法，对质粒DNA的提取效率也仅为69.2%，其余几种方法提取率均未超过50%［25］。随着cfDNA研究的不断深入，cfDNA的提取技术也在不断提高，提取率、DNA片段大小的覆盖范围、提取试剂对后续浓度测定的影响都是需要改进提高的方面。

2.3 cfDNA定量方法

2.3.1 qPCR

qPCR是目前cfDNA定量的主流方法。通过检测DNA中看家基因或稳定出现的某些非编码重复序列，达到cfDNA定量的目的。常用的靶序列有：β-actin、β-globin、GAPDH、TERT、RPPH1、ERV3、MSTN、ALU、L1PA2等。

目前，采用qPCR定量仍然存在不少问题：首先，定量时，测量的数据是cfDNA总浓度还是靶基因的浓度，很多文献在这一点上表述不清，极易造成误导。我们知道，qPCR实际测量的是靶基因的Ct值，然后再用标准曲线计算cfDNA的量。一般以ng/mL或拷贝数表示。那么，参考基因的量能不能代表cfDNA的总量呢？这要看制作标准曲线时采用的标准品是什么，通常有两种不同做法：①采用提纯的靶基因或重组质粒，这样计算出来的实际上就是靶基因的量，而不是cfDNA总量。只是以靶基因的量来“代表”cfDNA的量。②采用人基因组DNA为标准品。这样看似计算出的是cfDNA总量，但这是以“看家基因在基因组中的含量稳定且分布均匀”这一论断为前提的。而cfDNA中是否含有相同比例的看家基因，答案并不明确。虽然两种方法在表述上都是测的cfDNA的量，显然，采用不同标准品测出的数据是没有可比性的。理论上，以人类基因组DNA为标准品测得的数值应远高于纯靶基因质粒为标准品的数值。也就是说，测量看家基因只能“大致反映”cfDNA的水平。基于上述原因，采用单一靶基因检测cfDNA，虽说可以进行同一研究的横向比较，但在cfDNA绝对定量的准确性和标准化上仍需探讨。

不同参考基因测定同一标本的cfDNA浓度，是否可以得出一致结果呢？Devonshire AS等［23］比较了7个不同参考基因的qPCR定量并用数字PCR（digital PCR，dPCR）进行验证，一些参考基因（比如TERT）测得的cfDNA的量平均高于其他内参基因（比如ERV3）2倍以上。研究认为使用多内参基因的分析及取平均值可对cfDNA总量给出更加可靠的估计。此外，在cfDNA定量时，在待测血浆中加入所谓外源性标准DNA对照（EDC），可评估提取效率、提取产物的线性度、共纯化抑制物的存在以及cfDNA片段大小对定量的影响［21］。

qPCR定量cfDNA时的另一个问题是，定量前是否需要血浆或血清DNA的提取。多数qPCR的定量研究均为先提取cfDNA，后qPCR定量。毫无疑问，这样会造成cfDNA的损失。损失的DNA量可能比提取量还要大。Umetani等［26］尝试不需DNA纯化直接定量cfDNA：进行qPCR之前，血浆或血清用备好的缓冲液和蛋白酶K处理，以去掉蛋白质，通过扩增两种长度的ALU序列对cfDNA定量。Sarah Breitbach等［22，27］在反应混合物中加入一种用于困难模板扩增的特殊聚合酶（velocity polymerase），该酶每10 s可延伸1 kb碱基，血浆1∶40稀释后，不需其他处理，直接加入反应体系进行qPCR测定血浆cfDNA浓度。结果显示，未经提纯的血浆中cfDNA的浓度是DBM试剂盒洗脱液（eluate）中cfDNA的2.79倍，在弃掉的流出液（flow-throug）中，发现了cfDNA总量的36.7%。可见，直接qPCR法操作更加简便，避免了cfDNA的损失，但其可靠性仍需更多的相似研究和对比研究加以验证。

2.3.2 荧光染料法

采用PicoGreen［14，28］、SYBR Green I等荧光染料法检测血浆cfDNA，取得了不错的效果。该法灵敏度高（可达pg水平），线性范围宽。常用的PicoGreen是一种新型荧光染料，广泛用于基因组DNA、病毒DNA、PCR扩增产物等微量双链DNA（dsDNA）的检测。可将血浆稀释后直接与Pico-Green染料1∶1混合，在荧光酶标仪、荧光计等设备检测荧光即可。2010年版中国药典三部提出，荧光染料法检测的线性范围为1.25～80 ng/mL［29］。有商业化试剂盒称可检测低至25 pg/mL的dsDNA。由于荧光染料法灵敏度高、操作简便，有学者认为［30］，此法为检测cfDNA的最佳方法。

2.3.3 bDNA技术

近年来，bDNA信号放大的定量检测技术被用于cfDNA的定量检测。bDNA技术是一种建立在DNA杂交基础上的检测技术，类似于Southern blot 或ELISA法，针对选定的靶序列，比如ALU序列，设计专门的捕获辅助探针（capture extender，CE），CE两端分别与靶序列和捕获探针结合，靶序列再与一系列标记辅助探针（1abeled extender，LE）、信号放大探针、酶标记探针等相连，最后检测酶与底物的反应强弱［31］。该法的最低检出限可达0.86 ng/mL［32］。bDNA技术不需DNA提取步骤，具有灵敏度、特异性较高、操作简便的优点，但该法目前在国内应用不多。

bDNA技术与qPCR技术在检测cfDNA上有相似点，都是对某一靶序列的量进行检测，来定量cfDNA总量。可能也会存在qPCR上出现的类似问题，比如单靶基因、不同靶基因带来的定量差异，标准品的选择等。而且不同靶序列，需要设计专门的捕获辅助探针。bDNA技术与qPCR法的比较研究显示［33］，两法的血清游离DNA水平呈正相关，但bDNA技术测得的cfDNA浓度中位数（252.2 ng/mL）是qPCR法（65.5 ng/mL）的近4倍。qPCR法中cfDNA的提取损失应该是其浓度低于bDNA法的主要原因之一。

2.4 甲基化cfDNA的定量方法

cfDNA中的甲基化DNA的检测主要是指甲基化ctDNA的检测。由于ctDNA具有含量极低这一不利于检测的特性，因此，甲基化ctDNA的检测基本上是基于PCR技术和测序技术上的检测。PCR主要用于cfDNA中某特定基因或序列的甲基化检测，而测序可对整个cfDNA的甲基化状况进行检测。

甲基化ctDNA的定性检测可通过甲基化特异性 PCR（methylightion specific PCR，MSP）来实现。之后，Eads等［34］将MSP与qPCR技术相结合，实现了甲基化DNA的定量检测，即经典的Methylight法，或称qMSP法。这种定量是一种相对定量，通过计算PMR（percentage of methylated reference）值对目的基因甲基化水平进行量化。但问题来了，PMR的计算方式并不统一。其一：PMR=该公式实际是2-ΔΔCT的一种百分化形式，是以全甲基化阳性对照为100%计算出的甲基化百分数，PMR值应在0～100%之间，代表甲基化基因占全部靶基因的百分比。阳性对照甲基化不完全，样品与对照拷贝数的差异可能会导致PMR值＞100%。其二：PMR=2-（Ct样本靶基因-Ct样本内参）×100%。这种是以内参基因的量为对照标准计算出的甲基化靶基因的相对量。PMR值上限不固定，取决于基因组中靶基因与参考基因之间的相对量。第一种PMR计算方法更易于理解和相互比较。不管哪种计算方式，必须考虑靶基因和内参基因扩增效率是否一致的问题。

Methylight法与最近发展起来的数字PCR （dPCR）相结合，产生了数字Methyligh或称为Methyligh dPCR。Methyligh dPCR比qPCR具有更高的敏感性［35］。dPCR可直接对拷贝数进行绝对定量而不需制作标准曲线。dPCR由于单链模板进入分区并被扩增，可能产生拷贝数被高估的情况。

另一类定量方法是基于甲基化依赖限制性内切酶（MDRE）或甲基化敏感的限制性内切酶（methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE）的PCR分析。MSRE或MDRE消化含数个CpG位点的靶序列，通过qPCR扩增，计算甲基化的相对量。MSRE或MDRE法的局限性在于靶序列中必须含有相应的含CpG的酶切位点，且酶切消化能否达到100%，也是影响结果的重要因素。

重亚硫酸盐转化的DNA，还可通过测序评估全cfDNA的甲基化状态［5］。测序技术的发展，提供了更大的基因组覆盖和测序深度。测序可通过单分子定量，大范围高通量的识别所有甲基化胞嘧啶。

Redshaw等［36］使用系列梯度的甲基化DNA标准样本，对Methylight、Methyligh dPCR、MSRE/ MDRE-qPCR和-dPCR以及测序法进行了对比评估。Methylight qPCR表现出最好线性。测序分析精密度较高，但准确性不如qPCR和dPCR，高估了甲基化含量。当甲基化＜25%时，qPCR和dPCR法的精密度降低。

测序并未如我们期待的那样，成为精密度和准确性最高的方法。测序要想成为甲基化定量的金标准，技术上仍有改进的空间。而且测序设备昂贵，临床普及应用尚有难度。

3 展望

cfDNA做为新兴的生物标志物，由于各种内、外因素的影响，其组成及浓度变化较大，且含量较低，不易检测。根据检测目的和靶标的不同，每种检测方法各有其优势和局限性。当今主流的检测方法，基本是基于PCR技术的各种扩展延伸，荧光染料法等方法由于自身的优势，也逐渐得到认可。尽管存在缺乏检测流程的规范和标准化等诸多问题，但这只是前进道路中必然遇到的问题，相信通过更多的、更大样本量的研究以及检测技术的改良进步，这些问题都将逐步得到解决。

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Quantification of circulating cell free DNA and the existing problems

LI Tiejun★,ZHANG Xiaowei
（Jinan health science exchange and service center,Jinan,Shandong,China,250013）

Circulating cell free DNA(cfDNA)are closely related to human disease.In recent years, as a noninvasive biomarkers,cfDNA showed great prospect for clinical application.Because of its extremely low content,a large number of studies have been done to develop various methods for quantitative detection.At the moment cfDNA quantitative detection still faces problems such as the lack of specification and standardization in detection processes.In this paper,we reviewed the source of cfDNA,quantitative methods and existing problems of detection,and hope to give a beneficial reference for improving the reliability of the quantitative detection.

Circulating cell free DNA;Standardization;PCR

济南市卫生科技交流服务中心,山东,济南250013

★通讯作者：李铁军，E-mail：ltj6902@sina.com