补肾壮督散水煎液对大鼠腰椎间盘退变的影响及其机制

张震，刘海全，林一峰，唐汉武，宋振杰，王利仁

(1广州中医药大学，广州510006；2广州中医药大学第三附属医院)

·基础研究·

补肾壮督散水煎液对大鼠腰椎间盘退变的影响及其机制

张震1，刘海全2，林一峰2，唐汉武2，宋振杰2，王利仁2

(1广州中医药大学，广州510006；2广州中医药大学第三附属医院)

目的 探讨补肾壮督散水煎液对大鼠腰椎间盘退变的影响及其可能机制。方法 将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补肾壮督散组、塞来昔布组，各10只。除假手术组外，其余各组均采用腰椎纤维环全层穿刺法制备腰椎间盘退变模型。造模第2天，补肾壮督散组和塞来昔布组分别给予补肾壮督散水煎液、塞来昔布胶囊水溶液灌胃，假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃，连续8周。各组处死后取出椎间盘组织，HE染色后观察病理变化，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色后透射电镜观察超微结构，Western blotting法检测椎间盘组织基质金属蛋白酶3(MMP-3)蛋白表达。结果 假手术组椎间盘纤维环层次分明，与髓核界限分明；成纤维细胞呈梭条状，细胞质内细胞器较发达。模型组椎间盘胶原纤维排列紊乱，与髓核界限消失；成纤维细胞细胞质内细胞器不发达。补肾壮督散组椎间盘纤维环层次较分明，与髓核界限分明；成纤维细胞细胞质内细胞器稍不发达。塞来昔布组椎间盘纤维环层次较补肾壮督散组紊乱，与髓核界限欠分明；成纤维细胞细胞质内细胞器较不发达。假手术组椎间盘组织MMP-3蛋白相对表达量为0.198±0.028，补肾壮督散组为0.525±0.056，塞来昔布组为0.809±0.029，模型组为1.065±0.055；各组椎间盘组织MMP-3蛋白相对表达量依次升高，组间两两比较P均<0.05。结论 补肾壮督散水煎液灌胃可延缓大鼠腰椎间盘退变；抑制腰椎间盘组织MMP-3表达可能是其作用机制。

腰椎间盘退变；补肾壮督散；基质金属蛋白酶3；大鼠

腰椎间盘退变是导致腰背痛的主要原因之一[1]。腰椎间盘退变的基本病理变化是细胞外基质(ECM)的降解，而基质金属蛋白酶(MMPs)在椎间盘ECM的降解过程中发挥重要作用。MMP-3是椎间盘ECM降解的关键酶之一，其在退变的椎间盘组织中高表达[2]。2014年9月～2016年3月，本研究观察了补肾壮督散水煎液对大鼠腰椎间盘退变的影响，现分析结果并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：雄性SD大鼠40只，SPF级，3月龄，体质量(250±20)g，均购于广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号：粤监证字2008A002。药物及试剂：补肾壮督散(海马5 g、鹿角胶10 g、黄芪30 g、熟地黄20 g、细辛4 g)由广州中医药大学附属骨伤科医院制剂室制备成散剂，取温开水500 g冲溶，过滤去渣，蒸馏水调整定容至500 mL，药物含量为1 g/mL，4 ℃条件下保存备用。塞来昔布胶囊购于辉瑞制药有限公司，水合氯醛购于国药集团化学试剂有限公司，MMP-3兔多克隆抗体抗体(一抗)购于武汉博士德生物工程有限公司，羊抗兔二抗购于丹麦Dako公司。电子显微镜购于日本日立公司。

1.2 模型制备与分组处理 采用随机数字表法将40只大鼠随机分为假手术组、模型组、补肾壮督散组、塞来昔布组，各10只。除假手术组外，其余各组均参考文献[3]的方法采用腰椎纤维环全层穿刺法制备L5、6腰椎间盘退变模型，假手术组仅暴露椎间盘，不穿刺。术后单笼饲养，每只大鼠肌注8万U青霉素，连续应用3天。造模后第二天上午8时补肾壮督散组予补肾壮督散水煎液1 mL/100 g灌胃，塞来昔布组予塞来昔布胶囊水溶液1.25 mg/kg灌胃，假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃；均为1次/d，连续8周。

1.3 相关指标观察

1.3.1 椎间盘组织超微结构及病理情况 术后8周每组随机抽取5只，麻醉后处死，迅速取出L5、6椎间盘组织。以椎间盘中线为界，于损伤侧椎间盘外纤维环取1 mm3的组织块，置于30 g/L戊二醛缓冲液中固定24 h，加入10 g/L锇酸固定2 h，梯度丙酮脱水，环氧树脂812包埋。光镜下定位后行超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色。于7 500倍电子显微镜下观察椎间盘组织成纤维细胞和胶原纤维结构。将剩余椎间盘组织置于4%中性多聚甲醛溶液中固定24 h，经脱水、石蜡包埋，4 μm厚切片，烘烤后二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，进行HE染色。40倍光镜下观察椎间盘组织病理变化。

1.3.2 椎间盘组织MMP-3蛋白表达 采用Western blotting法。术后8周将剩余5只大鼠的L5、6椎间盘组织置于玻璃研磨器中捣碎，裂解液裂解后充分匀浆。冰上裂解30 min，4 ℃条件下14 000 r/min离心5 min，取上清。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度合格后备用。10% SDS-PAGE凝胶恒压电泳，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V。湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶恒温封闭1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶20 000)进行杂交。以GAPDH为内参，ECL化学发光剂显影、定影，采用Image J 软件行MMP-3蛋白半定量分析。

2 结果

2.1 椎间盘组织超微结构及病理变化 椎间盘组织超微结构：假手术组椎间盘组织束状纤维平行排列，胶原纤维排列紧密，成纤维细胞呈梭条状，外形较圆滑，细胞质内细胞器较发达。模型组椎间盘组织束状纤维不完全孤立，胶原纤维排列较稀疏，成纤维细胞体型较小，细胞质内细胞器不发达。补肾壮督散组多数束状纤维平行排列，胶原纤维排列较紧密，成纤维细胞外形不圆滑，细胞质内细胞器稍不发达。塞来昔布组束状纤维间之间不完全孤立，胶原纤维排列稍稀疏，成纤维细胞外形不圆滑，细胞质内细胞器较不发达。椎间盘组织病理变化：假手术组椎间盘纤维环层次分明，呈同心圆形，排列规则整齐，胶原走行清楚，与髓核界限分明。模型组部分纤维环破裂，椎间盘胶原纤维排列紊乱，与髓核界限消失。补肾壮督散组椎间盘纤维环层次较分明，呈同心圆形，与髓核界限分明。塞来昔布组椎间盘纤维环层次较补肾壮督散组紊乱，与髓核界限欠分明。2.2 椎间盘组织MMP-3蛋白表达 假手术组椎间盘组织MMP-3蛋白相对表达量为0.198±0.028，补肾壮督散组为0.525±0.056，塞来昔布组为0.809±0.029，模型组为1.065±0.055；各组椎间盘组织MMP-3蛋白相对表达量依次升高，组间两两比较P均<0.05。

3 讨论

椎间盘是人体最早退变的器官，腰椎间盘退变最早可发生在10岁左右[4]。腰椎间盘退变是一个复杂的病理过程，由多种因素共同参与，如遗传因素、细胞代谢失衡、椎体结构的改变、新生血管长入、免疫炎症等[5]。近年来，中药复方治疗腰椎间盘退变多有报道，其延缓腰椎椎间盘退变的作用也越来越受到关注[6～8]。补肾壮督散是一种具有温肾强督作用的中药复方；塞来昔布是临床常用的环化酶2抑制剂，不仅可以消炎止痛，还能够增加椎间盘组织中的蛋白多糖水平，降低软骨细胞凋亡指数，延缓椎间盘退变[9]。本研究显示，与假手术组比较，模型组增生的胶原纤维排列紊乱，与髓核界限消失；成纤维细胞体型较小，细胞质内细胞器不发达；说明采用腰椎纤维环全层穿刺法制备腰椎间盘退变模型成功。本研究补肾壮督散组椎间盘纤维环层次较分明，与髓核界限分明，成纤维细胞外形不圆滑，细胞质内细胞器稍不发达；而塞来昔布组椎间盘纤维环层次较补肾壮督散组紊乱，与髓核界限欠分明，成纤维细胞外形不圆滑，细胞质内细胞器较不发达；两组椎间盘组织病理和超微结构改变均较模型组轻。说明补肾壮督散可以延缓大鼠腰椎间盘的退变，其效果优于塞来昔布。

腰椎间盘退变的主要表现为细胞减少和ECM降解，而ECM的丢失是导致椎间盘力学特性丧失的主要原因，ECM的合成和降解失衡可直接导致腰椎间盘退变[10，11]。MMPs是最重要的一类ECM分解蛋白酶，在腰椎间盘退变组织中表达显著升高[12]。MMP-3在ECM的降解过程中起着关键作用，不仅可以直接裂解胶原蛋白，还可以直接降解蛋白多糖和糖蛋白，更重要的是MMP-3还能激活其他潜在的MMPs，产生瀑布效应，发挥间接促ECM降解作用。MMP-3还能够降解椎间盘组织的胶原蛋白和蛋白多糖。Jing等[12]研究发现，在退变的髓核组织中MMP-3能够抑制Ⅱ型胶原蛋白表达，加速腰椎间盘退变。本研究假手术组、补肾壮督散组、塞来昔布组、模型组椎间盘组织MMP-3蛋白相对表达量依次升高，组间两两比较差异均有统计学意义；说明补肾壮督散延缓大鼠腰椎间盘退变的作用机制与其降低MMP-3蛋白表达有关。

综上所述，补肾壮督散水煎液灌胃可通过降低椎间盘组织MMP-3表达而延缓大鼠腰椎间盘退变，但其具体的作用机制尚需进一步研究。

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国家自然科学基金资助项目(81574000)；广州中医药大学中医骨伤科学国家重点学科开放基金资助项目(ZD06)。

林一峰(E-mail： lyf@gzucm.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.009

R681.53

A

1002-266X(2017)16-0033-03

2016-03-20)