微生物降解低阶煤的研究及产物腐植酸的应用

王若楠 邱小倩 刘 亮 袁红莉 陈文新

(中国农业大学生物学院 北京 100193)

微生物降解低阶煤的研究及产物腐植酸的应用

王若楠 邱小倩 刘 亮 袁红莉*陈文新

(中国农业大学生物学院 北京 100193)

腐植酸的合理施用是实现农业减施化肥目标的重要措施，是对国家新时代绿色化发展号召的积极响应。煤炭是植物残体在一定的地质条件下经过微生物的分解转化形成。低阶煤由于其煤化程度低、灰分及含水量高，容易被微生物降解转化形成水溶性腐植酸类产物。本文从腐植酸资源及其重要性、目前已报道的能降解褐煤的微生物资源、微生物降解褐煤的机理及降解产物腐植酸的应用等方面进行了详细的论述，并提出今后低阶煤微生物转化的研究和发展方向，以期为利用生物技术降解转化矿源腐植酸的研究及产品开发应用提供参考。

腐植酸 褐煤 微生物降解 黄腐酸

腐植酸是动植物残体(主要是植物残体)在复杂的地质环境下经过微生物的分解和转化，以及一系列的化学过程而积累起来的一类有机物质[1]，广泛存在于土壤、水体以及泥炭、褐煤、风化煤中。腐植酸具有独特的结构和理化性能，其作用涉及到地球化学循环的各个方面。腐植酸肥料已作为一种功能性肥料广泛应用于农业生产，它可以增强土壤活力、促进植物生长、增强植物根系活力、提高植物抗逆性、提高肥料利用率、减少肥料使用量，与国家十九大中“绿水青山就是金山银山、绿色发展、环境问题、生态系统保护”的发展理念相吻合，符合绿色化发展的新时代政策，符合现代农业可持续发展的要求。目前主要的两大类腐植酸是矿源腐植酸和生物腐植酸。生物腐植酸一般是以工农业有机废弃物为原料，经微生物发酵而成的腐植酸；矿源腐植酸主要是指存在于泥炭、褐煤及风化煤等矿产资源中的腐植酸，也是目前市场上腐植酸产品的主要来源[2]。

我国矿源腐植酸资源丰富，储量大且分布广。据统计，有泥炭124．8亿吨，居世界第4位；褐煤1303亿吨，还有大量的风化煤约1000亿吨[3]。这些低阶煤含大量的原生腐植酸，因其煤化程度低，稠环结构少，脂肪链状结构多，含有更多类木质素结构，结构更趋近于原始植物残体，使其易于被微生物降解。大量研究表明，相比于物理化学法，利用微生物降解煤生产腐植酸的技术具有能耗低、转化条件温和、转化效率高、污染小、能实现资源的可持续化利用、转化产物的整体经济效益和应用价值高等优点[4，5]。泥炭因结构简单最易降解，但可开发的资源有限。除泥炭外，褐煤是最易降解且储量丰富的低阶煤，目前国内外生产腐植酸多以褐煤为主要原料。下面就以褐煤为例从降解菌种类、降解机制、产物腐植酸的特点和应用方面综述微生物降解低阶煤的研究进展，并对未来的发展趋势进行展望。

1 褐煤的生物转化

褐煤是煤化程度较低的煤种，具有芳香环缩合度小，侧链、桥键及活性官能团含量高的特点，且含有类木质素结构的物质，使其易于被微生物分解转化[6]。早在20世纪80年代Fakoussa和Cohen等[7，8]就发现假单胞菌和白腐菌可以降解褐煤，开启了煤炭加工新领域，尤其在利用微生物降解褐煤等低阶煤产生腐植酸/黄腐酸方面引起了研究者的极大关注。在之后的几十年里，通过不懈的努力，丰富了煤炭生物转化的菌种资源，揭示其降解机制，同时不断开发降解产品且拓展其应用，从而加速了煤炭的转化和清洁利用。

2 褐煤降解转化的微生物资源

迄今为止发现的能降解煤的微生物主要有细菌、真菌和放线菌。放线菌报道相对少，主要有Streptomyces viridosporus T7A、Streptomyces setonii 75Vi2、Streptomyces badius、Streptomyces flavovirens、Actinosynnema sp．和Nocardia sp．等[9，10]。继Fakoussa发现褐煤降解细菌恶臭假单胞菌Pseudomonas putida后，又发现一些芽孢杆菌，如Bacillus subtilis、Bacillus pumilus、Bacillu scereus也具有降解能力。此外，还有节细菌属Arthrobacter sp．，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa，球红假单胞菌Rhodopseudomonas spheroids[11，12]。真菌是降解煤的主要微生物，报道最多的是担子菌中的Phanerochaete chrysosporium[13]。其他真菌有Trametes versicolor、Polyporus versicolor、Poria placenta、Coriouls versicolor、Paecilomyces Tli、Penicillium、Mucor、Aspergillus terricola、Aspergillus ochraceus、Cunning hamella sp．、Pleurotus florida、Pleurotus ostreatus、Pleurotus caju、Pleurotus eryngii、Trichoderm aviride、Stropharia sp．、Fusarium oxysporum、Ascomycota Hypocrea lixii[14]、Laetiporus sulphureus[15]、Golden Mushroom[16]、 酵母Canadida sp．也具有降解煤的能力。

除了传统的分离培养方法筛选褐煤降解微生物，也有研究者通过诱变育种和基因工程等方式来获得高效褐煤降解菌，如Yuan等[17]通过对一株褐煤降解力强的Penicillium sp． P6进行紫外及亚硝基胍诱变，明显提高了该菌的降解能力；徐敬尧等[18]通过对黄孢原毛平革菌进行原生质体紫外诱变选育，获得了高效的煤炭生物降解转化菌株。

自然环境中物质的降解是由多种微生物协同完成的，单一菌种不足以完全降解褐煤。因此从20世纪80年代开始，人们研究不同微生物间的协同降解作用，逐步形成了混合培养技术。但是目前的混合培养技术主要是利用纯培养的菌株组合，而自然界中许多高效降解微生物无法通过纯培养得到，因此直接从自然界筛选获得菌群是近年来研究的热点。Maka等[19]从褐煤中分离到2个低阶煤降解菌群，经鉴定发现主要组成为：细菌Bacillus subtilis、Bacillus pumilus、Bacillus scereus和真菌Aspergillus sp．，但褐煤降解率低，添加未经化学法处理的褐煤，2个菌群在培养25天后，降解产物在425 nm处吸光值低于0．2；而Gao等[20]从低阶煤储量丰富的地区采集样品，筛选到3组高效降解菌群，其中菌群MCSL-2含有2类细菌Bacillus lichenoformis和uncultured Stenotrophomonas，对未经处理的新疆风化煤降解25天后，产物在腐植酸特征吸收峰450 nm处吸光值高达30，经过41天培养几乎可以全部降解，且降解产物具有明显的生物活性，推测这种高效降解可能是因为不同降解菌分泌的降解酶系间的互补作用。

虽然已报道的褐煤降解微生物种类繁多，但是大量的研究证明，同一降解菌对不同的低阶煤降解效果差异很大，因此针对具体的褐煤资源选育相应的高效降解菌株或菌群将是今后工作的一个重要方向。

3 微生物降解褐煤的机理

基于大量的实验结果，研究者们提出微生物可能主要通过分泌到细胞外的碱性物质、螯合剂和表面活性剂、生物酶等对褐煤进行降解。

3.1 碱性物质

Quigley等[9]首次发现微生物可通过分泌氨、生物胺、多肽及其衍生物等碱性物质使褐煤发生脱质子化，形成黑色液体。1988年Strandberg等[10]发现Streptomyces setonii 75Vi2可分泌一种对蛋白酶不敏感的小分子活性物质来促进煤溶解，进一步证实了该结论。后续研究发现，培养液的pH越高，煤的溶解量就会越高，而培养液pH的高低与其中多肽或多胺的含量有关[21]。Jiang等[22]发现具有较高褐煤降解能力的Bacillus sp． Y7会产生一种碱性物质降解褐煤，该物质耐高温且对蛋白酶不敏感，具有蛋白类似结构，其含有的νN-H、νC=O和δN-H是与褐煤降解相关的主要功能基团。Gao等[20]也发现菌群MCSL-2降解风化煤的主要因素是产生了碱性物质。

3.2 螯合剂和表面活性剂

褐煤大分子结构中含有由多价阳离子形成的盐桥，微生物生长过程中产生的螯合剂与煤中的金属离子结合，导致煤大分子结构瓦解，从而实现煤的降解。1990年，Cohen和Feldmann[23]首次发现Trametes versicolor产生的螯合剂草酸胺参与了褐煤液化过程。Ralph[24]证实去除金属离子后，褐煤的分子量明显降低，进一步从侧面说明了螯合剂在微生物破坏褐煤结构上的作用。

表面活性剂可以在不需要打断煤共价键的情况下促进许多极性物质的溶解，帮助微生物降解褐煤。但是由于其不能打断共价键，使得其单一作用时效果不佳[25]，所以表面活性剂主要通过提高相关降解酶的吸附来促进褐煤的降解。Yin等[26]发现表面活性剂可以通过增加煤表面的亲水性，促进酶的吸附使其更好地发挥作用。Yuan等[17]发现Penicillium decumbens除产生碱性物质外也可分泌表面活性剂类物质溶解褐煤。

3.3 生物酶

褐煤含有类木质素结构，碱及螯合剂和表面活性剂增加了煤的溶解性，增溶后的解聚作用需要生物酶，尤其是木质素降解酶的参与[27]，其可以打断煤分子的共价键，从根本上将大分子结构降解，在腐植酸的解聚中起决定性作用。褐煤降解酶主要可以分为氧化酶和非氧化酶类[28]。氧化酶包括木素过氧化物酶(Lignin peroxidase，LiP)，锰过氧化物酶(Manganese peroxidase，MnP)和漆酶(Laccase)，非氧化酶主要为酯酶[29]，目前对氧化酶的研究较为深入。

3.3.1 木素过氧化物酶(LiP)

木素过氧化物酶是一类糖基化亚铁血红素蛋白酶，是唯一能直接氧化富含电子的非酚型芳香化合物的酶[30]。其对木质素的降解需要H2O2的参与，具体步骤为LiP首先与H2O2反应生成复合物I，然后复合物I失去一个电子形成复合物Ⅱ，最后回到含Fe(III)的原始酶状态，这样酶催化循环得以维持。1989年Wondrack等[31]发现Phanerochaete chrysosporium产生的LiP经初步纯化后可以部分降解硝酸处理的褐煤和德国次烟煤中的煤炭聚合物。随着研究的深入，还发现LiP可以对褐煤和被甲基化的碱溶性褐煤进行脱色和解聚[32]。Yadav等[33，34]从Gloeophyllum sepiarium MTCC-1170和Lenzitus betulina MTCC-1183的培养液中纯化到的LiP可以在H2O2存在的情况下降解褐煤。杨金水等[35]发现褐煤降解菌Penicillium decumbens P6会分泌LiP来降解褐煤。

3.3.2 锰过氧化物酶(MnP)

MnP的酶促反应循环与LiP相似，包括原始酶、复合物I、复合物II的氧化还原状态。但是与LiP不同的是MnP的还原反应需要Mn的参与，Mn2+将复合物I和复合物II还原，自身被氧化成Mn3+。MnP最大的优势在于它的催化反应是通过氧化还原中间体Mn(II)/Mn(III)进行，它们可以在解聚反应中再生。同时，由于它们足够小可以很容易地进入煤颗粒，而其他相对较大的酶分子却不能直接进入煤颗粒对煤进行降解。

Hofrichter[36]首次发现Nematoloma frowardii b19的MnP粗提液可以将褐煤腐植酸类物质解聚形成低分子量的黄腐酸，进一步利用MnP解聚14C标记的腐植酸类物质，发现腐植酸类物质转化为小分子量的黄腐酸的同时，有相当的14CO2释放，证明MnP能直接降解腐植酸[37]。姜峰[38]发现Pseudomonas sp． G6产生的MnP可降解褐煤释放水溶性腐植酸，进一步将高分子量的腐植酸转化成低分子量的黄腐酸；Gao等[20]发现菌群MCSL-2对褐煤的降解也有MnP参与。

3.3.3 漆酶(Laccase)

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能够非特异性催化多种芳香族化合物的氧化，同时将O2还原成水[39]。漆酶的催化中心包含4个顺磁性的Cu2+，作用于酚、醛芳烃形成苯氧自由基，然后经过非酶催化反应，如自由基之间的聚合、歧化、水的亲核攻击等，最终导致烷基-苯基键的断裂、Cα氧化或酚的去甲基化等[40]。

Cohen[41]于1987年首次提出漆酶是使褐煤降解的原因之一。之后有许多关于漆酶在褐煤降解中发挥作用的研究。褐煤来源的腐植酸可以诱导Bjerkandera adusta R59产生大量的漆酶[42]；Neosartorya fischeri ECCN 84可以产生氧化酶尤其是漆酶来降解褐煤供自身生长[43]；Wang等[44]从低阶煤中分离到许多木质素降解菌，并从菌中扩增出漆酶类多铜氧化酶基因，均说明漆酶在褐煤降解中的作用。

3.3.4 酯酶

除了氧化酶，酯酶在褐煤降解中也发挥一定的作用。有研究表明，Trametes versicolor产生的酯酶和金属螯合剂等对褐煤降解的贡献比漆酶更大[23]。Hölker等发现14C标记的褐煤经过酯酶降解后，检测到其中的酯键发生断裂，表明酯酶可以降解褐煤[45]。冯建敏[46]对具有降解液化褐煤能力的2株真菌胞外酶活力进行检测，发现均表现出高酯酶活性，且纯化后的酯酶可以液化褐煤，证明酯酶在褐煤液化中确实起到了重要作用。但酯酶分子较大，难以进入致密的煤分子结构中，且其催化过程没有小分子物质作为介质，直接导致酯酶作用的空间障碍，所以酯酶的作用机理还需要进一步研究[45]。

1981年，Fakoussa等[7]就发现褐煤降解有微生物产生的酶、碱性物质、表面活性剂及螯合剂的作用，随后Yuan等[17]也发现斜卧青霉Penicillium decumbens P6能同时分泌碱性物质、表面活性剂和胞外酶来高效降解褐煤。Ghani等[25]表明煤降解机制涉及到氧化及非氧化酶、螯合剂、表面活性剂及碱性物质。由此可见，微生物对褐煤的降解是单一机理为主，还是多种机理共同作用，还需要做针对性的研究。

4 微生物降解褐煤技术及降解产物——腐植酸的应用

褐煤经过微生物降解作用后，可以释放其中的腐植酸，并在降解酶的作用下进一步将大分子腐植酸解聚成分子量更小的物质如黄腐酸。腐植酸含有多种活性官能团，虽然已经广泛应用于农业、畜牧业、工业和医药行业[47]，但主要是矿源腐植酸，经微生物转化褐煤得到的腐植酸的应用报道很少。吴秀珍等[48]在玉米和白菜田间试验区施用真菌降解褐煤的产物，发现对玉米和白菜有明显的增产作用，可部分改善作物品质和土壤性质；柳丽芬等[49]的试验结果也表明煤微生物转化产物可以使白菜增重高达对照的6倍。以上研究表明，微生物转化褐煤的产物具有土壤调节剂及植物生长刺激素的应用潜力。张明旭等[50]用煤微生物转化的水溶性液态产物作添加剂制备水煤浆，与添加1%萘系添加剂的水煤浆相比，其各项指标都较优，价格也与萘系添加剂差不多，暗示其在工业生产中的利用价值。杨鑫[51]发现微生物降解褐煤得到的黄腐酸对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀有抑制作用，即具有抗氧化性和抗炎性，说明其可以应用于医药行业。

袁红莉等[52]从1987年开始了微生物降解褐煤生产黄腐酸及高活性腐植酸的系统研究，经过30年的持续努力，筛选出一批针对我国不同产地褐煤的高效降解菌，建立了利用组合菌进行阶段发酵降解褐煤生产腐植酸的工艺技术流程，该技术不使用任何化学试剂，产品多元化而且无废弃物，实现了资源的全利用。对降解获得的腐植酸类物质的特性进行了详细研究，发现产物分子量变小、含氮量增加、生物活性更高[53]。在多年的田间应用示范工作中，发现该黄腐酸喷施或拌种可以显著增加多种作物(西红柿、黄瓜、西瓜、甜叶菊、玉米、大豆)的产量并改善品质，如提高西红柿中Vc及糖含量；通过调节甜叶菊糖合成基因及其内生菌群落组成，明显提高甜叶菊甜菊糖产量，同时显著提高莱鲍迪苷A在总糖中的含量，改善甜菊糖口感，为甜叶菊糖苷作为食品添加剂的推广应用提供了重要的技术基础[54]。在河北、河南、山东多地的大豆种植试验中发现，通过喷施或根灌500 ppm的黄腐酸能显著提高大豆结瘤率和固氮酶的活性，促进大豆生长，并使大豆产量提高12．6%～26．3%。进一步采用蛋白组学手段研究发现，黄腐酸可以加快大豆根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense CCBAU 05525)的代谢和营养的摄入，提高大豆根瘤菌的细胞密度以及诱导根瘤菌nod基因的表达，最终能够促进大豆的结瘤和固氮酶活[55，56]。

近30年来，我国化肥用量逐年攀升，虽然化肥的使用保证了农业的高产和稳定发展，但我国单位作物播种面积平均施用量已达到国际公认化肥施用安全上限的1．61倍[57]。寻求农业绿色化生产方式已成为我国农业发展的重中之重。在减少化肥用量的前提下，开发并利用腐植酸类多功能且环境友好的新型肥料将成为提高农作物产量和品质的关键[58，59]。目前，国内外大公司纷纷开始关注腐植酸类植物生长调节剂的研发，微生物降解褐煤生产腐植酸技术具有极大优势，该技术符合可持续发展理念，且我国褐煤资源储量巨大，不仅实现了褐煤资源的有效利用，增加其附加值，而且从农业可持续发展角度上助力实现“土肥和谐”。

5 展望

低阶煤微生物降解转化技术，实现了低阶煤资源的高效利用，降解产物也广泛应用于各个领域，前景十分广阔，但是仍然需要进一步优化来提高效率。优化低阶煤的微生物降解转化可以从以下3个方面展开工作：(1) 选育降解效果显著、适应性广的菌株(菌群)：可以通过传统的分离筛选方法，及新型的诱变育种和基因工程手段获得优质菌种；(2) 降解机制的进一步完善：随着分析技术和手段的不断发展，复杂的煤结构能够进一步被解析，加速菌-煤之间的相互作用机制的研究，促进降解转化过程；(3) 降解产物的获得、分析及应用拓展：目前微生物降解褐煤的产物纯化及分析技术仍不完备，相应技术的不断更新，有利于产物的分析，进而开发更有价值的产物。

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Research on Microbial Degradation of Low-rank Coal and Application of Biodegradation Product Humic Acid

Wang Ruonan, Qiu Xiaoqian, Liu Liang, Yuan Hongli*, Chen Wenxin
(College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing, 100193)

The reasonable application of humic acid is an important way to achieve the goal of decreasing chemical fertilizer in agriculture. It is a positive response for the new era of national green development called. Coals are formed by plant residues which undergo the decomposition and transformation by microorganisms under the certain geological conditions. The low-rank coals, characterized with low degree of coalif i cation and high content of ash and water, were easy to be transformed into soluble humic acid by microorganisms. This paper discussed the resources and signif i cances of humic acid, microbial resources and mechanisms of lignite degradation, and the application of humic acid in detail.Furthermore, the research and development trends of the microbial conversion of low-rank coals were prospected to provide references for the application of microbial degradation of lignite and the exploitation of mineral humic acid.

humic acid; lignite; microbial degradation; fulvic acid

TQ314.1，Q939.99

1671-9212(2017)06-0003-07

A

10.19451/j.cnki.issn1671-9212.2017.06.001

2017-06-05

王若楠，女，1992生，在读博士研究生，主要研究方向为环境微生物。*通讯作者：袁红莉，女，教授/博士生导师，E-mail：hongliyuan@gmail.com。