蛋白质组学技术在中医药防治糖尿病及并发症研究中的应用进展＊

秦田雨，秦灵灵，吴丽丽，孙文，潘雅婧，宋紫临，张程斐，刘铜华

蛋白质组学技术在中医药防治糖尿病及并发症研究中的应用进展＊

秦田雨1，秦灵灵2，吴丽丽3，孙文3，潘雅婧1，宋紫临1，张程斐1，刘铜华4＊＊

（1.北京中医药大学中药学院北京100029；2.北京中医药大学科技处北京100029；3.北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室北京100029；4.北京中医药大学研究生院北京100029）

糖尿病是以长期高血糖为主要临床特点的全身慢性代谢疾病。蛋白质组学从整体蛋白质的水平，更深入地发现和探讨糖尿病的发病机制，现在在中医药研究中已有较多应用。本文对蛋白质组学在中医药干预糖尿病及其并发症中的研究应用进行综述，包括糖尿病及并发症的中医证候蛋白质组学筛选验证，以及相关中药药理机制的蛋白质组学分析，并进行了展望，以期为中医有关糖尿病的病机理论以及中药作用靶点提供新的线索和依据，深化中医药干预糖尿病研究。

蛋白质组学糖尿病中医药证候

1994年，澳大利亚学者Wilkins等首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，指一个细胞内的全部蛋白质[1]。蛋白质组学本质上是指在大范围上研究蛋白质的特征，包括细胞内随时间变化的蛋白质表达、翻译后的修饰、蛋白之间的相互作用等，并且能够从蛋白质水平上全面而整体地认识疾病发生发展的过程和机制[2]。其研究方法包括前期的样本提取纯化，中期的蛋白分离鉴定，以及后期的数据处理分析。蛋白质分离技术包括双向电泳（2-DE），双相荧光差异凝胶电泳（2DDIGE）以及多维液相色谱技术。2-DE是等电聚焦电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-Polyacrylamide Gelelectrophoresis，SDS-PAGE）的组合。蛋白分离后再结合不同的质谱分析方法进行蛋白分析鉴定，目前主要应用的质谱鉴定技术主要有电喷雾串联质谱（ESI-MS/MS），基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和表面增强激光解吸飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）等；而定量分析技术包括iTRAQ、SILAC、SWATH等。酵母双杂交技术则利用酵母的转录激活因子GAL4具有两个独立结构域的特性来研究蛋白质之间的相互作用，具有较高灵敏度。最后以生物信息学方法辅助获取信息、并进一步分析信息。

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，影响了全球数亿人口，其早期诊断和并发症预防对治疗疾病具有重要意义。糖尿病属于中医“消渴”范畴，中医药在防治糖尿病及并发症方面积累了丰富经验。目前中医药干预糖尿病及并发症的蛋白质组学研究主要集中于中医证候和中药药理研究。中医病机的复杂性与蛋白质组表达的差异性都是机体即时动态性功能状态的反映，蛋白质的多样性和分子间的复杂网络关系与中医病机复杂多样和开放式网络特点也有很多相似之处[3]。下面从应用蛋白质组学的技术和方法研究糖尿病证候和药物机制两方面进行综述，将有助于解读中医病机理论以及中药干预糖尿病机制的本质和科学内涵。

1 糖尿病证候的蛋白质组学研究

王琪[4]等采用iTRAQ同位素标记蛋白质组学技术，对非肾虚痰瘀型和肾虚痰瘀型糖尿病患者，以及健康人的血液进行分析，筛选差异蛋白，发现肾虚痰瘀与健康对照组相比，21种蛋白上调（微管蛋白、踝蛋白、胰岛素样生长因子2等），15种蛋白下调（血清白蛋白、抗凝血酶3、血小板反应蛋白、角蛋白等）。肾虚痰瘀型与非肾虚痰瘀型组相比，13种蛋白下调（角蛋白2、角蛋白1、脂联素等），7种蛋白上调（踝蛋白、微管蛋白等）；其中提示通过对血小板反应蛋白的关注，可以对早期肾虚痰瘀型2型糖尿病做出诊断。

糖尿病肾病常见于病史超过5年的患者，因而早期发现诊断肾损伤并依据证型辩证治疗是很有必要的。柴可夫[5]等以早期糖尿病肾病患者尿液为标本，用2-DE结合质谱分析方法，进行三种证候早期糖尿病肾病的比较蛋白质组学研究，检测出Nogo蛋白、单克隆抗体IgM在肝肾阴虚证高表达，IgKappa链、转铁蛋白、动力蛋白在气阴两虚证高表达，分子量52047.8白蛋白、转甲状腺素蛋白、ɑl-抗胰蛋白酶在脾肾阳虚证高表达。其中广泛参与炎症趋化，损伤修复的Nogo蛋白可以作为三种证型的鉴别依据，吻合了机体抗炎修复损伤机制与三种证型出现顺序的关系，为中医病证诊断客观化提供了科学依据。

卢洪梅[6]等运用荧光差异双向电泳技术分析正常人与糖尿病肾病肾阳虚证患者血浆中蛋白差异表达谱，共发现泛素化因子、载脂蛋白E、补体成分C4、细胞角蛋白、补体C3等9种差异表达蛋白，可能成为糖尿病肾病中医证型诊断的靶向性生物标志物。卢洪梅还分析了正常人和早期糖尿病肾病肾阴虚患者血浆，筛选出表达差异大于1.5倍的蛋白斑点进行质谱分析，鉴定出11种差异蛋白质，包括结合珠蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白AI，为总结肾阴虚证的一般规律奠定了基础[7]。

未来如能应用蛋白质组学的技术方法，建立常见的糖尿病证候图谱，对于研究糖尿病患者的中医体质类型分布规律以及诊断、辨证施治、预防都将很有裨益。

2 中药干预糖尿病的蛋白质组学研究

单药方面，有研究[8]通过蛋白组学的方法发现了瓜蒌水提物的蛋白质组的组成，包括一种全新的蛋白成分，认为瓜蒌蛋白可能是潜在的有降血糖效果的蛋白。另外有研究[9]应用SELDI-TOF-MS技术首次发现，在293个潜在生物标志中，人参皂苷通过降低CRP减轻炎症治疗糖尿病及其并发症，并后续进行了ELISA方法验证，提示人参皂苷通过抗炎机制在治疗糖尿病血管病变方面的前景。

复方研究方面，陈红谨[10]采用同位素标记技术，利用高效液相色谱仪及四级杆-静电场轨道阱质谱仪，对糖尿病大鼠进行串级质谱数据分析，给药组与对照组比较，共得到40个差异蛋白，其中上调大于1.5倍的蛋白有肉碱乙酰转移酶等11个，下调小于0.75倍的有表皮生长因子受体等29个。从蛋白质分子水平上发现了复方益糖康能够改善糖脂代谢的生物学基础。

赵静[11]应用单纯高脂高糖喂养以及高脂高糖联合腹腔注射STZ复制出两种2型糖尿病大鼠模型，运用iTRAQ标记蛋白组学技术，比较观察两种模型的病理及中医证候及血清蛋白组学特征，认为STZ联合高脂高糖饮食模型大鼠为气阴两虚痰瘀证，apoBl00、apoC4和FCN2可作为潜在的2型糖尿病生物标志物，CYR61可作为潜在的气阴两虚痰瘀证生物标志物；并探查益气养阴化痰祛瘀方对气阴两虚痰瘀证2型糖尿病大鼠模型的分子作用靶标（CDC42、RhoA、CYR61），揭示该方与该病证相关的生物学基础。

在天芪降糖胶囊的研究中，研究者[12]应用双向电泳结合辅助激光解吸电离质谱研究发现，天芪降糖胶囊可以恢复四氧嘧啶造糖尿病模型导致的载脂蛋白E、载脂蛋白AI、Ig gamma-2A链C区蛋白下调，以及转体基因，结合珠蛋白，血清淀粉样蛋白P-componen、凝血酶原的上调，并且后续使用ELISA方法验证了该结果的准确性。

消渴丸为含有中草药和格列本脲的中成药，临床用于治疗2型糖尿病。Zhang X等[13]在一个48周、纳入800名患者的临床试验之后，通过匹配要素选择其中32例患者进行血清蛋白质组学分析，分为有/无低血糖的格列本脲治疗组及有/无低血糖的消渴丸治疗组。通过联合运用iTRAQ、LC及MS/MS技术对血清蛋白质分别标记、分离和鉴定。研究结果显示，25种蛋白在无低血糖的有/无消渴丸治疗中表现出不同丰度；21种蛋白在有低血糖的有/无消渴丸治疗中表现出不同丰度；24种蛋白在无低血糖的有/无格列本脲治疗中表现出不同丰度；25种蛋白在有低血糖的有/无格列本脲治疗中表现出不同丰度。在无低血糖组中，有5种蛋白质，包括ɑ型胰蛋白酶抑制剂重链H4，胆固醇基酯转移蛋白，载脂蛋白C，组蛋白H2B和ɑ2巨球蛋白，对这两种药物表现出相同的反应丰度；在有低血糖组中，包括组蛋白H2B，载脂蛋白C，ɑ2巨球蛋白，ɑ间胰蛋白酶抑制剂重链H1，ɑ型胰蛋白酶抑制剂重链H4，补体成分C9，生物素酶和补体成分C8γ链这8种蛋白对两种药物的丰度变化相同。使用同样药物的有/无低血糖的患者血清蛋白差异程度大于不同药物之间的差异。血清蛋白对两种不同抗糖尿病药物治疗的反应可作为敏感的生物标志物来评估治疗效果，并为后续机制研究铺路。

3 中药干预糖尿病并发症的蛋白质组学研究

糖尿病相关认知减退是由糖尿病引起的以认知障碍为主要症状的脑损伤，与认知涉及的突触中断相关，特别在突触后密度的区域中，存在高浓度的接收和转导突触信息的蛋白质。Chen J等[14]首次使用相对和绝对定量同位素标记技术（iTRAQ）联合LC-MS/MS技术，鉴定糖尿病认知功能障碍及滋补脾阴方治疗后大鼠的突触后密度蛋白表达，每个样本均分别进行了三个生物性和三个技术性重复。空白组与模型组比较有24个差异蛋白，模型组与治疗组比较共有23个差异蛋白。其中“内质网相关蛋白”和“PI3K-Akt信号通路”在糖尿病相关认知减退中可能受损，而生长因子受体结合蛋白2可能是滋补脾阴方神经保护作用分子靶点中的重要蛋白质。

施翔等[15]研究复方滋补脾阴方对糖尿病认知下降大鼠海马的比较蛋白质组学影响结果，发现并鉴定了滋补脾阴方药的6个作用靶分子，为研究糖尿病相关认知下降的发病机制和药物作用靶点提供了新的依据，也为中医糖尿病病机理论的深化研究奠定了基础。

Zhang T[16]等将大鼠通过注射链脲佐菌素建立大鼠糖尿病性周围神经病（DPN）模型，将大鼠分为模型组、硫辛酸组合糖络宁组，对背根神经节的线粒体蛋白进行蛋白质组学分析。结果显示，与模型组比较，糖络宁组有388个差异表达蛋白，其中线粒体复合物III显著降低，谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物酶显著增多。与模型组比较，硫辛酸组有251个差异表达蛋白。与硫辛酸组比较，糖络宁组线粒体复合物III增多，线粒体复合物IV减少。因此糖络宁的抗氧化作用可能与通过调节呼吸复合体和抗氧化酶有关。

4 总结与展望

综上所述，在中医药干预糖尿病的研究中蛋白质组学方法和技术已得到相对广泛运用，并且取得了一定的成果。但其应用中还存在许多技术上的不足,如重复性不够理想，灵敏度低，定量精度低，数据库信息不完整，研究需大量时间并且费用昂贵等[17]。比如，虽然MALDI-TOF-MS是识别潜在疾病生物标志物的最有效和最敏感的方法之一,但是有研究[18]使用MALDITOF血清分析方法没有发现肾阴虚证和非肾阴虚证患者之间的血浆谱中的差异峰，最可能的原因可能是等离子体分析方法不够灵敏，表明MALDI-TOF血清分析方法的可能性和局限性。而在某些情况下[19]，使用不同的蛋白质分离方法从蛋白质组学分析中鉴定的蛋白质中仅有＜30%的重叠。因此在中医证候研究中，应鼓励使用多种蛋白质组学技术，比对结果互相参考。

更进一步讲，虽然蛋白组学有相比于其它组学不可代替的优势，如反映了基因与环境互动下的蛋白质实时变化，然而不可否认两种及更多组学方法联合使用是阐明药物反应、生物学途径和新型生物标志物的有力工具，可以弥补一种技术的缺陷，是未来糖尿病中医药研究的趋势。另外可以进一步完善组学数据库，具有节时、省力的长远获益。

目前中医药糖尿病的蛋白质组学研究多集中于比较糖尿病个体与正常个体样品，筛查和鉴定其中差异表达的蛋白，分析的组织大多是尿和血清，可以进一步比较不同组织中的蛋白质组学差异。随着蛋白质组学技术的发展完善、研究数据的丰富和系统化，未来发展的重点将集中于针对部分具有标记物功能的重要蛋白的功能进行系统研究，为了解糖尿病及其慢性并发症的发病机制、鉴定疾病的分子标志、理解中医整体证候的实质、寻找中医药干预靶点提供新的途径。

1Abbott A.And now for the proteome.Nature,2001,409(6822):747.

2贾永森,司春富.蛋白质组学技术在中医证候本质研究中的优势.河南中医,2008,28(1):9-10．

3周红光,陈海彬,周学平,等.蛋白质组学是中医病机研究的重要技术平台.中国中西医结合杂志,2012,32(7):990-993．

4王琪,哈木拉提.吾甫尔.基于蛋白质组学分析研究中医肾虚痰瘀型2型糖尿病的生物学基础.新疆医科大学学报,2015,38(6):696-699.

5柴可夫,马超,王宏献.早期糖尿病肾病不同证候的尿蛋白组学研究.中华中医药学刊,2015,33(10):2311-2314.

6卢洪梅,汤水福,胡坤华.早期糖尿病腎病肾阳虚证的血浆蛋白质组学分析化.广州中医药大学学报,2014,31(6):890-894.

7卢洪梅,邹立华,汤水福,等.基于2D-DIGE技术对早期糖尿病肾病肾阴虚证型患者血浆蛋白质组学研究.中国中医基础医学杂志, 2016,22(6):812-815.

8Lo H Y,Li T C,Yang T Y,et al.Hypoglycemic effects of Trichosanthes kirilowii and its protein constituent in diabetic mice:the involvement of insulin receptor pathway.BMC Complement Altern Med,2017,17(1):53.

9Cho W C,Yip T T,Chung W S,et al.Altered expression of serum protein in ginsenoside Re-treated diabetic rats detected by SELDI-TOF MS.J Ethnopharmacol,2006,108(2):272-279.

10陈红谨,刘小溪,连捷,等.中药益糖康治疗糖尿病大鼠的蛋白组学研究.中华中医药刊,2017,35(2):477-481.

11赵静.基于蛋白组学技术对2型糖尿病大鼠病证模型特点及中药复方干预作用的研究.北京,北京中医药大学博士论文,2016.

12 Zhang S X,Sun H,Sun W J,et al.Proteomic study of serum proteins in a type 2 diabetes mellitus rat model by Chinese traditional medicine Tianqi Jiangtang Capsule administration.J Pharm Biomed Anal,2010, 53(4):1011-1014.

13 Zhang X,Sun H,Paul S K,et al.The serum protein responses to treatment with Xiaoke Pill and Glibenclamide in type 2 diabetes patients.Clinical Proteomics,2017,14(1):19.

14 Chen J,Zhan L,Lu X,et al.The Alteration of ZiBuPiYin Recipe on Proteomic Profiling of Forebrain Postsynaptic Density of db/db Mice with Diabetes-Associated Cognitive Decline.J Alzheimers Dis,2016,56 (2):471-489.

15 Shi X,Lu X G,Zhan L B,et al.The effects of the Chinese medicine ZiBu PiYin recipe on the hippocampus in a rat model of diabetesassociated cognitive decline:a proteomic analysis.Diabetologia,2011, 54(7):1888-1899．

16 Zhang T,Gao Y,Gong Y,et al.Tang-Luo-Ning Improves Mitochondrial Antioxidase Activity in Dorsal Root Ganglia of Diabetic Rats:A Proteomics Study.Biomed Res Int,2017:8176089.

17郭宏.糖尿病及其慢性并发症蛋白质组学研究进展.中华中医药杂志,2013,28(1):11-14.

18 Jiang N,Liu H F,Li S D,et al.An integrated metabonomic and proteomic study on Kidney-Yin Deficiency Syndrome patients with diabetes mellitus in China.Acta Pharmacol Sin,2015,36(6):689-698.

19 Van Eyk J E.Overview:the maturing of proteomics in cardiovascular research.Circ Res,2011,108(4):490-498.

Application Development of Proteomic Technology in Research of Chinese Medicine Preventing and Treating Diabetes and Its Complications

Qin Tianyu1,Qin Lingling2,Wu Lili3,Sun Wen3,Pan Yajing1,Song Zilin1,Zhang Chengfei1,Liu Tonghua4
(1.Collage of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Technology Department of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3.Key Laboratory of Chinese Medicine Healthcultivation of The Ministry of Education,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 4.Graduation School of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Diabetes is the general chronic metabolic disease,with chronic hyperglycemia as the main clinical characteristic.Proteomics discusses and explores the pathogenesis of diabetes more deeply from the overall level of proteins,which has been frequently applied in Chinese medicine research.This paper summarized proteomics application in the study of Chinese medicine intervening diabetes mellitus,including screening and verification of proteomics in Chinese medicine syndromes of diabetes and its complications,as well as proteomics analysis of pharmacological mechanism of related Chinese medicine.This paper also prospected its outlook,in hope toprovide new clues and basis for the pathogenesis theory of diabetes in traditional Chinese medicine(TCM)and functioning targets,and to deepen research on Chinese medicine intervening diabetes.

Proteomics,diabetes,Chinese medicine,syndrome

10.11842/wst.2017.05.010

R587.1

A

（责任编辑：韩馥蔓，责任译审：王晶）

2017-05-11

修回日期：2017-05-20

＊国家自然科学基金委面上项目（81373587）：糖痹康干预糖尿病周围神经病变氧化应激及其信号通路的研究，负责人：刘铜华；科学技术部国家“十二五”科技支撑计划课题（2014BAT10B04）：中药干预糖调节受损临床疗效评价研究，负责人：刘铜华。

＊＊通讯作者：刘铜华，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：中医药防治糖尿病及其并发症的临床和基础研究。