转基因作物影响土壤微生物群落多样性的研究

赵 佳，聂园军，黄 静，陈 哲，梁 宏

（山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

转基因作物影响土壤微生物群落多样性的研究

赵 佳，聂园军，黄 静，陈 哲，梁 宏

（山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

转基因技术在提高作物抗逆性、增加粮食产量方面贡献卓越的同时，对包括土壤微生物群落在内的土壤生态系统的风险评估一直存在争议。大多数研究表明，转基因作物的种植会引起土壤微生物群落多样性的变化，但其对土壤微生物群落多样性的影响程度、持续作用时间等都没有定论。综述了外源基因及其表达产物进入作物根际的方式与不同类型外源基因及其表达产物对土壤微生物群落多样性的影响；并对转基因作物影响土壤微生物群落的研究手段进行了讨论，提出了下一步的研究策略。

转基因；土壤微生物群落；高通量测序

转基因技术在农业生产领域快速发展，目前全球转基因作物的种植面积高达1.5亿hm2，我国的种植面积为400万hm2[1]。一方面转基因技术在提高作物抗逆性、增加粮食产量上贡献卓越；另一方面转基因作物大面积种植对于生态系统可能的影响也一直存在争议，这就使得转基因作物释放后的生态风险评估尤为重要[2]。2000年，美国EPA将转基因作物对包括土壤微生物在内的土壤生态系统的影响列为转基因风险评估的重要组成部分。

土壤微生物群落是土壤生态系统的重要组分，主导土壤中物质转化和能量交换等生化进程。微生物群落多样性的变化是评价土壤生态环境的重要生物学指标[3]。一般情况下，游离的DNA片段进入土壤后很快就会被微生物所分泌的核酸酶所降解，但一部分DNA却能与土壤中的黏粒和腐植酸等物质结合而变的难以降解，其在土壤环境中的存留时间超乎想像[4-5]。HOFFMAN等[6]在几种转基因作物中发现，抗抗生素基因（hpt）可通过进入土壤的残枝落叶，转移到与植株存在共生关系的一种黑曲霉中。另一方面，因外源基因导入引起作物根系分泌物组分发生变化，也可能对土壤微生物群落多样性产生影响。目前学界对于转基因作物是否影响土壤微生物群落安全性的争议较大，因此，研究其对于土壤微生物群落多样性的影响有重要的现实意义。

笔者综述了外源基因及其表达产物进入作物根际的方式与不同类型外源基因及其表达产物对土壤微生物群落多样性的影响，并提出了可能的研究策略，为转基因作物的生态安全性评价提供思路。

1 外源基因及其表达产物进入作物根际的方式

转基因作物的外源基因及其表达产物进入土壤后，可能会对作物根际微生物群落产生影响。目前，转基因作物的外源基因及基因表达产物主要通过以下几种方式进入土壤中：一是通过作物根系的分泌作用。作物的根系分泌物会改变土壤的理化性质，对根际生态系统产生巨大影响。外源基因的导入及表达会影响作物根系分泌物的组成，进而改变根际微生物群落结构多样性。如王建武等[7]研究发现，转Bt基因作物分泌的毒蛋白在根际还保有活性并能不断累积，它直接作用于根际微生物，可改变其群落结构，影响整个土壤生态系统。二是通过作物的残茬。随着作物秸秆还田的大规模推广应用，通过残茬进入土壤成为外源基因表达产物进入根际的最主要渠道。姚艳玲等[8]研究发现，转Cry1Ab基因高粱秸秆还田过程中，其表达产物在土壤中的降解周期为67 d。三是通过花粉扩散。转基因作物花粉的扩散是外源基因逃逸的方式之一[9]。

2 外源基因及其表达产物对土壤微生物群落多样性的影响

2.1 抗虫基因对土壤微生物群落多样性的影响

转基因作物使用的代表性抗虫基因是Bt杀虫蛋白基因，它是是目前应用最为广泛、商业价值最高的毒蛋白基因，转入该基因的作物能够合成一种对昆虫有毒的Bt毒蛋白而发挥作用。邹雨坤等[10]研究了种植转Bt基因玉米对其根际微生物群落的影响，结果表明，厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门等是转基因玉米与正常亲本根际的共有微生物，其群落结构相似性高；种植1 a转Bt基因玉米对其根际微生物群落结构无显著影响。WU等[11]研究发现，在含有Cry1Ab基因和非转基因水稻品系的根际土壤中，放线菌和真菌两大类群在数量上没有显著差异，而细菌类群中的氨氧化菌、纤维素降解菌和固氮菌于试验中期在数量上有显著但短暂的差异。但是，CASTALDINI等[12]研究发现，含有Bt基因玉米品系（Bt11和Bt176）和正常玉米的土壤根际微生物群落多样性存在巨大而持久的差异，尤其是丛枝菌根真菌的数量显著降低。以上研究结果表明，转抗虫基因对作物根际微生物群落多样性是否有影响目前还没有定论。

2.2 抗病基因对土壤微生物群落多样性的影响

目前，转抗病基因主要分为抗菌蛋白基因与系统获得抗性（SAR）相关基因两大类，通过导入这些相关抗病基因已经得到许多对作物病原微生物具有稳定抗性的转基因品种[13]。溶菌酶可降解微生物的细胞膜，对大多数细菌有效。AHRENHOLTZ等[14]研究发现，转T4溶菌酶基因马铃薯品系与非转基因对照相比，其根系对枯草芽孢杆菌的杀死活性高1.5～3.5倍，转基因品系抑菌效果显著。SESSITSCH等[15]研究了转抗菌肽基因的马铃薯对非靶标土壤微生物的影响，结果发现，转基因与非转基因马铃薯相比，在开花期能对土壤中的芽孢杆菌属细菌种群结构产生显著而暂时影响，但在块茎形成期二者间的芽孢杆菌属细菌种群结构存在高度相似性。系统获得抗性的启动需要信号分子水杨酸（SA）的累积，MEDINA等[16]研究发现，含有NahG基因烟草与水杨酸含量呈负相关，而含有CSA基因烟草与水杨酸含量呈负相关，丛枝菌根真菌在含NahG基因烟草生长早期数量上升，而在含有CSA基因烟草的根际数量下降；但在烟草生长后期二者与非转基因烟草根际的丛枝菌根真菌差别都不大。

2.3 抗除草剂基因对土壤微生物群落多样性的影响

含有抗除草剂基因的作物对土壤微生物群落多样性的影响近来受到学者的广泛关注。SICILIANO等[17-18]结合微生物群落水平多样性（CLPP）、脂肪酸甲基酯（FAME）与末端限制性酶切片段长度多态性（TARDRA）3种技术研究了不同时期转抗草甘膦油菜对根际微生物的影响。结果表明，与非转基因油菜相比，在生长季土壤微生物群落中的黄杆菌属与假单胞菌属数量上升，而芽孢杆菌属、微球菌属和贪噬菌属数量下降；但是在冬季，二者间的土壤微生物群落多样性不存在显著差异。这说明转抗草甘膦基因与非转基因油菜品系根际微生物群落间的差异是暂时的且随季节变化而消除。

3 转基因作物影响土壤微生物群落的研究手段

土壤中可培养微生物在数量上仅占总微生物量的0.1%～1%，而传统的分离培养方法仅能分离到可培养微生物，不可培养微生物的研究处于空白[19-20]。近年来，新的分子生物学研究方法不断取得突破，避开微生物的分离培养，直接对土壤中总微生物进行研究成为学者们的主要研究策略。

3.1 Biolog微平板分析方法

Biolog微平板反应系统是基于菌种不同的单一碳源利用能力上的差异来研究微生物种群功能多样性的。陆英等[21]利用Biolog微平板系统研究了转Gus-NPTⅡ基因香蕉对其根际土壤微生物群落的影响，结果表明，与对照非转基因香蕉植株根际土壤微生物群落相比，其土壤微生物在AWCD变化曲线和微生物群落5种主要指数上均不存在显著差异。王丽娟等[22]从大田中取样，利用Biolog技术比较了2种转基因大豆（PAT，ALS）与其非转基因亲本（PAT1，ALS1）及当地主栽品种（中黄 13）对根际土壤微生物群落多样性的影响，结果表明，多糖类、氨基酸与羧酸聚合物为微生物利用的主要碳源物质，从根际微生物活性来看，转基因大豆（PAT，ALS）活性最高，中黄13次之，非转基因大豆亲本（PAT1，ALS1）最低。Biolog微平板分析方法相较于其他方法具有检测周期短、操作简便和成本低廉等优势，但其只能反映微生物群落整体的丰富度，而无法获得群落中具体微生物类群的相对含量，有一定的局限性。

3.2 磷脂脂肪酸分析方法

微生物细胞壁或膜上存在一些特异性的化合物可以作为该物种的标记物，磷脂脂肪酸（PLFAs）分析法就是利用这些特异性标记物研究微生物群落多样性，这种方法直接提取微生物群落的脂肪酸而不需要进行菌的培养，将分析结果与相关数据库结合比对，可直观地反映根际微生物群落的结构、组成和生物量等信息[23]。刘微等[24]利用PLFAs对比分析转Bt基因水稻与非转基因亲本对根际微生物群落多样性的影响区别。他们利用PLFAs分析了各种脂肪酸含量发现，转基因水稻与非转基因水稻根际均以饱和脂肪酸、支链脂肪酸为主；在苗期、拔节期和抽穗期，与非转基因亲本相比，转基因水稻根际微生物群落中革兰氏阳性菌的磷脂脂肪酸含量低于革兰氏阴性菌，说明其根际微生物群落结构相较于非转基因亲本发生了改变；成熟期2种水稻根际微生物群落差别不大。综合分析水稻各生育期，转Bt基因水稻未对根际微生物群落的磷脂脂肪酸含量造成显著影响。PLFAs分析法可直观反映微生物群落中不可培养微生物的结构情况，扩展了微生物群落的研究范围，成为现阶段的主流分析方法。

3.3 高通量测序分析法

从根际土壤中直接提取微生物的总基因组DNA并进行高通量测序分析是近年来土壤微生物群落多样性研究的热点，已经逐渐取代变形梯度凝胶电泳（DGGE）、随机扩增多态性 DNA（RAPD）和扩增片段长度多态性（AFLP）等分子生物学技术[25]。这种技术是以微生物群落基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新型微生物群落研究方法[26]。SHEN等[27]利用高通量测序技术研究了连续2 a施用生物有机肥（BIO）、粪肥（PM）和化肥（CF）3种不同处理的香蕉根际微生物群落差异和枯萎病的发生情况，结果表明，相比于PM和CF，施用2 a BIO后香蕉根际细菌群落多样性上升，真菌群落多样性下降；群落中酸杆菌门、厚壁菌门等菌群相对丰度提高，而子囊菌门相对丰度降低；3种处理的根际微生物群落多样性差异显著。高通量测序法可在门、纲、目、科、属等不同分类地位下明晰各类群的相对含量，使长期检测某些微生物类群的动态演替变化成为可能，是转基因作物影响土壤微生物群落研究领域新的突破点。

4 存在的问题与展望

土壤根际微生物群落在土壤生态系统中居于核心地位，是反映土壤根际微生态变化的重要指标。有关转基因作物对土壤微生物群落多样性影响的研究报道很多，但是这些研究结果差异较大。有研究认为，与非转基因作物相比，转基因作物对土壤根际微生物群落多样性影响不显著，即使有也远小于壤质类型、地域分布、作物种类、栽培管理方式和季节交替变化等因素产生的影响；但另一些学者认为，转基因作物对土壤微生物尤其是根际促生菌、病原菌、菌根真菌等群落有显著影响。造成这种争议的原因是人们的研究还不够深入，土壤微生物学的研究方法还是以传统分离培养鉴定为主，存在很大的局限性[28-29]。这说明对土壤微生物群落组成与功能间的互作关系、土壤微生物群落多样性对于因季节、耕作等原因造成的正常波动和转基因作物对土壤微生物群落多样性影响的程度与风险间的界限等问题还有待进一步深入的研究[30]。土壤微生物群落高通量测序的基因组DNA序列信息可由MOTHER和QIIME等软件进行多组样本间的差异分析，由种属热图和柱状比例图等可视化数据直接得到组间不同微生物类群（精确到属水平）的相对丰度差异，直观显示差异位点。今后利用土壤微生物群落高通量测序技术对转基因作物进行多季节、长时间的跟踪检测，可更准确地为转基因作物土壤微生态环境评价提供依据。

转基因作物在释放和商业化种植前，必须进行土壤微生态环境的监测，即使未来大规模种植后，仍应进行长期的安全性风险评估。尤其是对不同类型的基因和不同作物品种，应该采取个例分析原则来长期定点、定位检测。转基因作物生态安全性研究任重而道远，眼前的争论是我们研究的动力。随着技术手段的不断更新，人们对转基因作物种植的利弊会有愈来愈清晰的认识，并做出正确的判断。

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Study on Effects of Transgenic Crops on Soil Microbial Community Diversity

ZHAO Jia，NIE Yuanjun，HUANG Jing，CHENZhe，LIANG Hong
（Research Center of Biotechnology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Transgenic technology plays an important role on improving crops resistance and increasing food production,but the risk assessment about transgenic crops on soil ecosystem in which microorganisms are involved has been controversial.Most studies showed that transgenic crops could affect the soil microbial community diversity.However,the degree and time of the affected were not settled yet.This paper summarized the ways which the exogenous gene and their expression products entered crop rhizosphere and the effects of different transgenic crops on soil microbial community diversity.And it discussed the research technologies about the effects and proposed strategy of the future.

transgene;soil microbial community;high-throughput sequencing

S154.3

A

1002-2481（2017）10-1702-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.10.31

2017-04-17

山西省科技自主创新能力提升项目（2015zzcx-22）；国家转基因作物新品种培育科技重大专项（2013ZX08003-001）

赵 佳（1983-），男，山西太原人，助理研究员，硕士，主要从事农田土壤微生物资源与利用研究工作。梁 宏为通信作者。