基因修饰DC疫苗在肺癌中的研究进展

简 艳综述 钭方芳审校

·综述与讲座·

基因修饰DC疫苗在肺癌中的研究进展

简 艳综述 钭方芳审校

基因修饰；树突细胞；肺癌

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]，大部分患者在确诊时已处于中晚期，手术和放化疗是肺癌的传统治疗模式。近年来，生物治疗逐渐成为肿瘤的第四大治疗模式，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂为肺癌患者的生存带来福音，以DC和CIK疫苗为基础的主动和过继免疫治疗也在临床上取得了一定成绩，但肺癌的5年生存率仍不足15%[2]。所以不断探索肺癌的发病机制及寻找新的治疗方式仍是攻克肿瘤的重要方向。以基因修饰的细胞免疫治疗可从分子水平激活免疫应答并重建机体免疫功能，对肿瘤干细胞或处于非增殖期的肿瘤细胞均有杀伤作用，是肺癌治疗模式的重要补充手段[3]。DC作为目前唯一能激活未致敏初始型T细胞的APC，能特异性地识别递呈肿瘤抗原，以特异性肿瘤基因转染DC制作个体化疫苗，在基因水平上针对患者制定精准化治疗方案，以此免疫荷瘤宿主，激发高效的抗肿瘤免疫应答，起到事半功倍的效果。本研究将具体描述基因修饰的DC疫苗在肺癌免疫治疗中的发展。

1 DC的生物学特性

DC来源于骨髓CD34+造血干细胞，因突起的伪足像树枝，故命名为树突状细胞，根据来源不同分为淋巴系DC和髓系DC两大类，淋巴系DC的前体与NK细胞、T细胞相同，髓系DC前体细胞与单核细胞和粒细胞相同[4]。根据成熟度不同DC功能有差异，未成熟的DC内含重要细胞器，包括内体或称MHCⅡ类小室和溶酶体等，高表达补体、Toll样受体，为DC摄取抗原提供结构基础；当未成熟DC摄取抗原后或受到某些因子刺激则分化为成熟DC，高表达共刺激因子(CD80、CD86、CD40、CD40L等)和粘附因子(IL12p35、IL12p40、IL12p70、IFN-γ等)，获得递呈抗原(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)及活化T细胞的能力[5]。

2 DC与肺癌的发生发展

2002年，Dunn等[6]在总结前人研究的基础上，经过大量基础和临床试验验证提出“肿瘤免疫编辑”假设，认为肿瘤形成在免疫应答中分为3个阶段：清除、平衡、逃逸，其中DC在免疫应答中起到关键作用。在肺癌的发生发展中，当宿主细胞发生癌变后，未成熟的DC经趋化作用从外周血进入肿瘤微环境，在肿瘤抗原刺激下形成成熟DC，上调抗原递呈能力，高表达共刺激因子，摄取肿瘤抗原与MHC结合成MHC-抗原肽复合物作为第一活化信号激活初始T细胞使之活化分化成为T辅助细胞(Th)和细胞毒T淋巴细胞(CTL)，从而启动体液免疫应答消灭表达HLA多肽的癌变细胞[7]；同时高表达IL-12、IL-6、TNF-a和IL-10，增强自然杀伤细胞的直接杀伤作用，作为第二活化信号增强机体对炎症或肿瘤的免疫应答[8]。DC分泌的趋化因子可专一性趋化初始型T细胞，促进T细胞在肿瘤部位的聚集，增强T细胞激发相应的免疫应答[9]。然而，由于肿瘤细胞遗传的不稳定性及异质性，可逃避DC识别和摄取，从而导致肿瘤细胞不断增殖甚至转移。有研究证实：肿瘤细胞一般低表达或不表达MHCⅠ、MHCⅡ类分子和细胞黏附分子，同时释放VEGF，TGF-β阻碍DC分化成熟，不利于加工形成MHC-抗原肽复合物，从而丧失抗原呈递功能，最终出现肿瘤增殖及转移[10]。 也有研究表明[11-12]：与正常组织相比，肺癌、喉癌和鼻咽癌等多种恶性肿瘤癌巢内DC数目不足；与正常供体DC相比，从肿瘤分离得到的DC明显缺乏抗原提呈功能，进一步支持了该假说。

3 肺癌相关抗原基因转染DC疫苗的制备方式

3.1 DC疫苗来源

目前用于临床免疫治疗的DC多来源于肺癌患者的外周血，亦可从骨髓、脐血中提取，但骨髓提取的有创性及脐血来源困难限制了使用；同时外周血淋巴系DC含量少，体外培养困难，故疫苗制作多来源于外周血的髓系DC。外周血分离出单个核细胞后，在白介素-4(IL-4)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的诱导下分化为成熟的DC。肿瘤抗原加载方式主要有抗原致敏和基因修饰两种，抗原致敏主要是将肿瘤细胞的全部抗原信息或特异性抗原肽通过接触融合共培养方式负载。这类疫苗制备方法简便，容易实施，但非相关抗原量大且种类多，有诱发自身免疫性疾病危险。基因修饰是通过特异性基因转染方式改变DC的遗传表达，精准个体化的提呈肿瘤抗原，避免了上述缺点。沈晨阳等[13]研究发现：单纯的热休克蛋白gp96-肽复合物/DC疫苗较肿瘤细胞粗提物/DC 疫苗诱导的淋巴细胞分泌产生更高的IFN-γ和更强烈的抗肿瘤免疫应答，究其原因为肿瘤细胞粗提物特异性不高或者丢失导致，进一步证明特异性的肿瘤抗原修饰DC疫苗效果更佳。

3.2 基因转染树突细胞的方式

3.2.1 物理化学法 物理法常用为显微注射法及电穿孔法，化学法常用如DNA-磷酸钙共沉淀法、二乙基氨基乙基-葡聚糖法、聚阳离子-二甲基亚砜法等，上述两种转染技术易于操作，具有可重复性，对靶细胞的影响因素少，但转染率相对不高。

3.2.2 非病毒基因转移法 将目的基因以非病毒载体包装携带，通过细胞膜内吞或膜溶合的方式将基因组导入靶细胞。常用试剂如阳离子脂质体和阳离子聚合物。它无免疫原性，且不携带致病基因，对负载的DNA大小不限制，可负荷RNA、核糖体及其他大分子物质。Zou等[14]将负载在阳离子脂质体上的p53用于肺癌的基因治疗，发现不管在体内还是体外实验中均可使肿块缩小，但脂质体的靶向性欠佳。

3.2.3 病毒载体转染法 以病毒作为载体将目的基因转染至靶细胞染色体从而获得持续表达，常用如：逆转录病毒载体、腺病毒以及单纯疱疹病毒等。病毒载体可承载比较大的外源基因，同时高表达多个目的基因，转染率较非病毒载体和物理化学法高，目的基因可持续表达，是目前常用的转染方式之一。Lin等[15]使用慢病毒作为MAGE-A3基因载体转染DC，发现转染率高达(80±2.5)%，转染后DC疫苗高表达CD80、CD86、HLA-DR，对表达MAGE-A3抗原的细胞株具有杀伤作用。

4 特异性基因修饰DC疫苗在肺癌中的应用

4.1 基因修饰DC疫苗治疗肺癌的优势

基因修饰DC疫苗相较于传统的DC疫苗治疗肺癌具有如下优势：①基因转染后DC疫苗能表达全蛋白序列，包含所有抗原位点，相较于单纯的外源性刺激能更有效地进行抗原递呈；②表达抗原时间更持久，增强抗原提呈能力，同时高表达共刺激因子和细胞因子的能力，对抗肿瘤细胞的抑制作用，具有更强的激发免疫应答反应能力；③病毒载体转染后刺激DC细胞成熟并延长存活时间，增强免疫应答；④基因修饰DC疫苗表达抗原精准，不含有正常人体抗原，不易诱发自身免疫疾病。基因修饰DC疫苗的高效性和安全性奠定了其在临床肿瘤治疗中的地位。

4.2 基因修饰DC疫苗在肺癌中的临床转化研究

肺癌的发生发展是一个多因素多阶段过程，其中外界理化因素是诱因，不同癌基因上调表达或抑癌基因突变、异常甲基化及缺失被认为是不同病理类型肺癌发生的早期分子事件。基于基因水平的改变，我们通过改造DC疫苗特异性呈递肿瘤抗原，达到杀伤肿瘤细胞的功效。有研究发现15%～20%的非小细胞肺癌患者存在RAS原癌基因突变，其中90%为K-RAS基因突变[16]。Zhao等[17]通过动物实验研究发现：K-ras 基因修饰的DC 疫苗相较于单纯DC疫苗组能更快更高效地缩小荷瘤小鼠肿块。针对约有50%以上的非小细胞肺癌出现抑癌P53基因突变[18]，有人评估了腺病毒转染特异性基因P53的DC疫苗在肺癌中的疗效和安全性，Ⅰ/Ⅱ期临床试验发现纳入的40%～50%患者有良好的抗肿瘤免疫应答，且无不良反应；Ⅲ期临床试验发现回输P53/DC疫苗有效率和进展率分别为78.6%和33.3%，进一步证实了特异性表达肿瘤抗原的DC疫苗的有效性和安全性[19]。细胞因子可使免疫细胞趋向癌巢中心，促进DC识别抗原并高表达共刺激分子，在抗肿瘤免疫应答中具有重要作用，Morandi等[20]研究发现，细胞因子修饰的DC疫苗能够持续表达并增强抗肿瘤免疫应答。陈吉泉等[21]研究发现IL-12基因修饰的DC疫苗可增强NK活性，更加高效地激发CTL抗肿瘤免疫应答。癌胚抗原(CEA)作为肺癌早期筛查的一个指标，侧面反映肿瘤的活动程度，吴军等[22]利用癌胚抗原重组痘苗病毒(rV-CEA)转染树突状细胞，发现转染了rV-CEA的DC疫苗表面高表达MHC-CEA抗原肽复合物、共刺激分子和细胞间粘附分子，高效地诱导免疫应答对抗分泌性CEA的肿瘤细胞。Ishikawa等[23]临床Ⅰ期研究发现半乳糖酰基鞘氨醇修饰的DC疫苗针对进展期肺癌有一定的治疗作用，且无不良应出现。CK19在肺癌中高表达，通过慢病毒将CK19转染至DC疫苗相较单纯DC疫苗，能够更高效地缩小荷瘤小鼠肺癌肿块[24]。

4.3 基因修饰DC疫苗治疗肺癌的不足

特异性基因修饰DC疫苗治疗肺癌具有广泛的前景，但仍存在不足之处。首先，基因工程制作的高耗时耗费在经济上存在一定的发展限制，仍需探索更高效简便安全的基因转染技术。其次，病毒转染DC后可能出现基因重组或互补致表达异常，具有潜在的致病危险。Zhang等制作了一种新型的溶瘤腺病毒疫苗：使用端粒反转录酶促进溶瘤腺病毒进行抗癌作用，单纯疱疹病毒腺苷激酶作为自杀基因控制溶瘤腺病毒的存亡，在体内外实验中证实了该新型疫苗的有效性和安全性[25]，可能克服DC疫苗病毒转染后的不良反应。

总之，基因表达异常是细胞癌变的原因之一，从分子水平上寻找新的治疗途径是目前肺癌治疗的研究热点，特异性基因修饰DC疫苗具有精准的靶向性和强大的抗原递呈能力，达到个体化免疫杀伤治疗，具有可靠的理论基础和成功的临床前期试验基础，是目前理想的、有希望的治疗途径之一。但由于基因工程的耗费、技术的限制及可能存在的细胞免疫治疗不良反应限制了其发展，广泛应用于临床仍需更严谨的疫苗设计和样本量更大的临床前期探索。

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江西省科技厅重大创新项目(编号：20143ACG70020)

330000 南昌大学医学院(简 艳)；330029 江西省肿瘤医院(钭方芳)

钭方芳

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.10.052

R734.2

B

1001-5930(2017)10-1735-03

2017-02-14

2017-03-23)

(编辑甘艳)